Ученые предложили метод, который позволяет быстро оценить, как клетки дрожжей реагируют на противогрибковые соединения. Исследователи использовали панель штаммов пекарских дрожжей, в которых 64 белка, вовлеченные в ключевые пути обмена веществ, были слиты с зеленым флуоресцентным белком GFP. Благодаря этому авторы смогли за короткое время получить данные для целого ряда новых противогрибковых соединений. Анализ этих данных помогает лучше понять механизмы действия соединений и выявить клеточные пути, которые могут служить мишенями для новых препаратов. Разработка упростит и удешевит поиск и тестирование лекарств от грибковых инфекций. Результаты исследования, поддержанного тремя грантами Российского научного фонда (РНФ), опубликованы в журнале Communications Biology.
Ежегодно от грибковых инфекций, в числе которых пневмонии и легочный аспергиллез, умирает более 1,5 миллиона человек во всем мире. При этом наибольшую опасность представляют штаммы болезнетворных грибов, устойчивые к существующим лекарствам. Количество же известных противогрибковых средств очень ограничено — существует всего несколько классов таких препаратов, и к ряду из них грибки — например некоторые виды кандиды, поражающие слизистые, — обрели устойчивость, а потому значительно хуже поддаются лечению. Для решения этой проблемы ученые ищут уязвимости в грибковых клетках, на которые можно нацелить новые препараты. Однако классические методы выявления таких мишеней (протеомный анализ, скрининг мутантных библиотек) требуют много времени и дорогостоящего оборудования.
Исследователи из Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН (Москва) с коллегами предложили простой и быстрый метод для выявления уязвимостей в грибковых клетках.
Авторы использовали в эксперименте пекарские дрожжи — удобный модельный организм, клетки которого быстро делятся и неприхотливы в выращивании. Сначала исследователи с помощью баз данных о белках определили 64 белка, которые выполняют в клетках дрожжей самые важные функции: отвечают за синтез аминокислот (строительных блоков для всех белков), защиту от окислительного стресса, выкачивание токсичных веществ из клетки, энергетический обмен и клеточное деление.
Из целой коллекции дрожжевых штаммов авторы отобрали 64 варианта дрожжей, в каждом из которых один из выбранных белков был помечен флуоресцентным «маячком» — пришитым к нему зеленым флуоресцентным белком GFP. При облучении синим лазером этот белок светится в зеленом спектре.
Далее авторы подействовали на клетки двенадцатью разными препаратами, среди которых были известные противогрибковые лекарства и новые, малоизученные вещества. С помощью прибора, анализирующего свечение клеток, исследователи оценивали, как изменялась интенсивность свечения флуоресцентных «маячков» в зависимости от используемого препарата. Свечение менялось, поскольку клетка в ответ на токсическое вещество (противогрибковый препарат) меняет уровень продукции некоторых белков, и эти изменения отражают характер воздействия лекарства.
Такой подход позволил избежать трудоемкого протеомного анализа, который требует много времени и дорогого оборудования. За короткое время ученые проанализировали клеточный ответ к 12 разным веществам и углубили понимание механизма их действия. Например, эксперимент дал возможность описать ранее неизвестный механизм действия алкилцитидинов — нового класса соединений с противогрибковой активностью, эффективность которых показана в том числе и против грибков, которые поражают объекты искусства и картины.
Оказалось, что в результате воздействия алкилцитидинов активируется биосинтез ароматических аминокислот, и это тесно связано с системами антиоксидантной защиты клетки. Это открывает возможность разрабатывать препараты, которые будут избирательно воздействовать на этот процесс и эффективно бороться с клетками болезнетворных грибков. Особо интересно то, что этот путь присутствует у грибов, растений и бактерий, но отсутствует у человека и животных. Таким образом, препараты, нацеленные на него, будут избирательно действовать на грибы и не затрагивать клетки человека.
«Наш подход позволяет оценивать клеточный ответ на противогрибковое соединение без трудоемкого протеомного анализа: достаточно измерить свечение клеток панели из 64 штаммов. Это быстрее и дешевле, чем полная протеомика, и, что важнее, дает информацию о клеточных процессах, вовлеченных в ответ на лекарство. Мы можем быстро выявлять соединения с новыми механизмами действия, а не просто получать данные "вещество убивает грибную клетку или нет". Метод отлично работает на модельных дрожжах, и в будущем мы надеемся расширить набор белков для более детальной характеристики механизмов действия отдельных соединений», — рассказывает участник проектов, поддержанных грантами РНФ, Михаил Агафонов, доктор биологических наук, руководитель группы геномного редактирования промышленных микроорганизмов ФИЦ Биотехнологии РАН.
В исследовании принимали участие сотрудники Российского университета дружбы народов (Москва), Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе (Москва) и Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН (Москва).
Информация и фото предоставлены пресс-службой ФИЦ Биотехнологии РАН
Источник фото: Виктория Бидюк / ФИЦ Биотехнологии РАН
