Мыши, рыбы и не только: как создают лабораторные модели опухолей? Интервью с исследователем рака В.С. Покровским

Ученые НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина развивают редкое для нашей страны направление: выращивают человеческие опухоли в эмбрионах рыбок данио-рерио, чтобы исследовать их рост и тестировать новые препараты. Параллельно специалисты используют в работе мышей, клеточные культуры и 3D-модели.

О том, почему без экспериментов на животных в онкологии пока не обойтись, что представляют собой злокачественные опухоли и могут ли они исчезать сами по себе, рассказывает директор НИИ экспериментальной онкологии и канцерогенеза НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Вадим Сергеевич Покровский. Ученый также рассуждает о том, когда раковые клетки могли появиться на Земле и какие организмы подвержены этому заболеванию. Подробнее — в нашем интервью.

Справка: Вадим Сергеевич Покровский — доктор медицинских наук, заведующий лабораторией биохимических основ фармакологии и директор НИИ экспериментальной онкологии и канцерогенеза ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава РФ, заведующий кафедрой биохимии им. ак. Т.Т. Березова Медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов Патриса Лумумбы».

— В своих экспериментах вы задействуете мышей и рыбок данио-рерио. Остается ли использование живых организмов неизбежным для изучения рака?

— К большому сожалению, да; хотя мы работаем не только с животными, но и с культурами клеток, и c 3D-моделями. Организации, контролирующие исследования ученых и регистрацию новых лекарств, так называемые регуляторы, стремятся уйти от моделей in vivo в сторону более простых систем, чтобы сократить использование лабораторных животных. Но полностью отказаться от них на текущий момент невозможно.

— Как именно подобные исследования регулируются с этической точки зрения?

— Существуют строгие этические протоколы и руководства, где детально прописаны правила обезболивания, условия содержания и критерии эвтаназии животных. Требования различаются в зависимости от того, о каких организмах идет речь: для крупных грызунов действуют одни нормы, другие актуальны только для мышей, третьи — для рыбок данио-рерио. В основе этой работы лежит международный базовый принцип трех R (3R): replace (замена), reduce (сокращение) и refine (совершенствование). Этими ориентирами руководствуются как сами исследователи, так и этические комитеты. Первая R предписывает заменять сложные виды животных более простыми: если можно обойтись без приматов, используются, например, собаки. Если можно не задействовать собак, берут кроликов, далее — крыс, мышей и т.д. Чем проще биологический объект, тем это лучше с этической точки зрения. Вторая R обязывает минимизировать количество животных в эксперименте. Перед началом работы нужно тщательно просчитать, действительно ли для статистики необходима, например, группа из 20 мышей или можно сократить их количество? Если математически доказано, что достоверный результат можно получить на пяти особях, эксперимент проводится строго на пяти. И последняя R — refine (совершенствование) — требует максимально облегчать страдания животных. Любые болезненные процедуры проводятся под наркозом или с обезболиванием. Эвтаназия выполняется наиболее быстрым и безболезненным способом. Существуют и жесткие ограничения, призванные не допускать избыточного токсического воздействия препаратов. Конкретно в нашей практике, например, очень многое зависит от размера опухоли: если она превышает критический порог и начинает причинять животному сильные страдания, его усыпляют максимально безболезненным способом

— А если не использовать животных, а смоделировать опухоль на компьютере?

— Пока невозможно полноценно смоделировать на компьютере даже одну-единственную эукариотическую клетку, не говоря уже об опухолях. Тем временем компьютерный дизайн не стоит на месте и уже успешно применяется для белков: с помощью математических алгоритмов мы можем предсказывать их пространственную структуру и поведение в водных растворах. Знаменитая нейросетевая модель AlphaFold достаточно точно просчитывает взаимодействие молекулы вещества с ее мишенью, например лекарства-ингибитора с ферментом. Но живая система гораздо сложнее.

Воссоздать поведение клетки, состоящей из огромного множества белков, ионов и низкомолекулярных соединений, которые непрерывно перемещаются, взаимодействуют и реагируют друг с другом в динамике, пока не под силу даже самому мощному суперкомпьютеру.

Когда мы переходим к комплексным биологическим характеристикам молекулы, например ее метаболизму или токсичности, компьютерные модели дают слишком большую погрешность. В итоге любые расчеты все равно приходится проверять экспериментально на живом организме, которым чаще всего становится не кто иной, как мышь.

— Выбор мышей в качестве объекта исследований понятен: как-никак, это млекопитающие, и генетически они нам ближе, чем другие лабораторные организмы. А как в экспериментальной онкологии помогают далекие от нас рыбки данио-рерио, с которыми также работают ученые вашего института?

— На самом деле работать с ними даже удобнее. Для моделирования опухолей мы задействуем не взрослых рыб, а их эмбрионы. На вторые сутки после оплодотворения икринка превращается в развивающийся эмбрион. В его желточный мешок можно ввести опухолевые клетки человека, и они демонстрируют там стабильный рост.

— А почему используется именно эмбрион? Ведь у людей рак чаще развивается в пожилом возрасте.

— Ученые больше всего заинтересованы в изучении именно опухолей человека. Злокачественные новообразования развиваются практически у всех живых существ, даже у насекомых, но это их собственные опухоли: то есть если бы мы использовали взрослую рыбу, то просто получили бы опухоль рыбы, а не человека. Чтобы вырастить человеческую опухоль в живом организме, необходимы особые условия. Первый путь — использовать мышей с искусственным иммунодефицитом, например, так называемых голых мышей (nude). Второй путь — эмбриональная модель. У эмбриона собственная иммунная система еще не сформирована, поэтому клетки человеческой опухоли не отторгаются, а стабильно и воспроизводимо растут, что нам и нужно. Существуют и другие, менее распространенные способы привить человеческую опухоль животному. Это, в частности, трансплантация в так называемые иммунопривилегированные органы, защищенные барьерами (глаза, головной мозг, семенники). Если пересадить клетки человека туда, иммунная система животного (допустим, кролика) до них просто не доберется.

— Кроме того, есть возможность переносить опухоль от одного животного к другому, по сути, заражая его.

— Да, это называется перевиваемыми опухолями животных. Сама практика зародилась еще в начале XX в. благодаря выведению линейных животных с идентичным генотипом. Они были похожи на однояйцевых близнецов, поэтому опухоль, развившуюся у одной особи, можно было пересадить другой без риска развития иммунного отторжения. Этим экспериментам уже около 120 лет. Первые линии мышей начал выводить американский генетик Кларенс Кук Литтл еще в 1907–1909 гг. С тех пор и до наших дней эти инбредные (генетически чистые группы животных, которые похожи друг на друга как однояйцевые близнецы — Примеч. ред.) линии мышей и их опухоли непрерывно живут в лабораториях и поддерживаются учеными. Опухолевый материал замораживается, а затем при необходимости вводится в питательной среде с помощью обычного шприца другой мыши той же линии и успешно приживается. Технологически все это действительно выглядит как заражение одних клеток другими.

— Человеческие опухоли животных создаются по такой же схеме?

— Да. Мы берем опухолевый материал непосредственно от пациента, переносим его в чашку Петри, наращиваем клетки до определенного объема, а затем прививаем их иммунодефицитным мышам. Это срабатывает во многих, хотя и не во всех случаях. Есть и второй вариант: сделать гомогенат (однородную жидкую массу, полученную путем механического измельчения и перемешивания биологической ткани в специальном приборе) первичной опухоли пациента и напрямую ввести этот материал мыши. Но, повторюсь, для этого обязательно нужно животное с подавленным иммунитетом.

— Если у мыши иммунодефицит, то вы не можете увидеть, как организм защищается от болезни. Получается, такие модели подходят только для проверки лекарств?

— Верно. Мы не можем оценить естественную защиту организма, поэтому современные иммуноонкологические препараты на таких мышах практически не тестируются. Из-за отсутствия нормальной иммунной системы невозможно понять, как организм реагировал бы на опухоль.

— Кстати, а почему у людей, больных раком, собственные иммунные клетки в какой-то момент перестают бороться с патологическим процессом на начальном этапе? Какие факторы должны совпасть, чтобы организм «упустил» этот момент? Ведь аномальные клетки появляются у нас регулярно, но, как правило, иммунитет с ними справляется.

— Причин много, и в каждом конкретном случае срабатывает целый комплекс факторов. Одна из самых частых уловок заключается в том, что опухолевые клетки выставляют на своей поверхности молекулярные маркеры, которые иногда называют сигналами «не ешь меня». Они связываются с ингибирующими рецепторами Т-лимфоцитов и блокируют их защитную активность. В норме Т-клетка уничтожила бы угрозу, но, получив этот ложный сигнал, она «думает», что все в порядке, и опухоль продолжает расти. Другой сценарий: опухолевые клетки выделяют сигнальные молекулы, препятствующие миграции иммунных клеток в зону поражения, или поддерживают там постоянное хроническое воспаление. В таких условиях макрофаги дезориентируются и могут атаковать здоровые ткани, не замечая саму опухоль.

Способов обмана иммунной системы у рака огромное множество, и они, к сожалению, эффективно работают. Это всегда многокомпонентный процесс.

Важно понимать, что в борьбе с раком нет и не будет какой-то одной «волшебной таблетки» или универсальной мишени. В любой опухоли присутствует от нескольких единиц до десятков мутаций. Эта мутационная нагрузка заставляет опухоль непрерывно меняться, а поскольку спектр генетических ошибок в каждом случае индивидуален и обширен, точечным воздействием на одну мишень победить болезнь, как правило, не удается.

— Вернемся к работе ваших лабораторий. Когда опухолевая модель успешно создана, каковы ваши дальнейшие шаги?

— Их очень много. В мире создано немало опухолевых моделей, и спектр их применения огромен: от изучения биологии раковой клетки до тестирования физических методов воздействия, лучевой диагностики или клеточной терапии. Тем не менее существующих моделей все равно остро не хватает. В дефиците, например, стабильные модели рака предстательной железы с гиперэкспрессией белка PSMA. Некоторые из них недоступны в России из-за патентных ограничений, другие плохо воспроизводятся или не приживаются на наших мышах, у третьих нестабильно выражен целевой антиген. Поэтому создание новых моделей — одна из ключевых задач экспериментальной онкологии. Модель служит базовым инструментом. Без нее исследователь не сможет протестировать ни одно новое химическое, биологическое или клеточное соединение.

— Планируется ли расширение вашего вивария? С какими еще животными вы хотели бы поработать?

— Да, у нас в планах масштабная модернизация вивария. Если говорить о животных, нам необходимо развивать собственное разведение линий с разной степенью иммунодефицита. Сейчас мы в основном работаем с мышами линии BALB/c nude, обладающими относительно умеренным иммунодефицитом (поражены только Т-клетки). Но есть линии с куда более глубоким угнетением иммунной системы, где выключены также В-лимфоциты, макрофаги и NK-клетки. На таких моделях человеческие опухоли приживаются значительно лучше.

Наш ближайший приоритет — расширение линейки именно таких глубоко иммунодефицитных мышей.

— В клинической практике изредка описывают случаи спонтанной регрессии, когда опухоль у пациента исчезает сама по себе. Существует ли такой феномен на самом деле? Сталкивались ли вы с чем-то подобным в своей работе?

— На спонтанное излечение надеются многие пациенты, но в клинике такие случаи имеют исключительно спорадический, единичный характер. Опухоль человека крайне гетерогенна (разнородна) по своему клеточному составу, поэтому без лечения она исчезает чрезвычайно редко. У лабораторных животных ситуация иная. В эксперименте, особенно при использовании трансплантируемых моделей, феномен спонтанного рассасывания встречается значительно чаще, чем у людей. Так, например, если у мыши сохранена здоровая иммунная система, она может вовремя идентифицировать введенные опухолевые клетки и полностью уничтожить их благодаря высокой способности опухоли вызывать иммунный ответ. Ярким примером, когда новообразование может регрессировать само по себе в ходе эксперимента, может служить карцинома Эрлиха — одна из старейших классических лабораторных опухолей мышей, которую ученые непрерывно используют в онкологических исследованиях с начала ХХ века.

— То есть ключевой фактор здесь — способность иммунной системы распознать антигены опухоли?

— Именно. Если в структуре опухоли есть явные антигены, которые здоровая иммунная система животного способна распознать, защитные клетки быстро ликвидируют угрозу. В остальных случаях опухолевые клетки успешно прячут свои маркеры и обманывают организм. Так что в эксперименте элемент спонтанного регресса встречается гораздо чаще, чем в реальной онкологической практике.

— Хотя это и не ваш прямой профиль, исследовались ли детально те редкие случаи спонтанного исчезновения опухолей у людей? Известны ли механизмы?

— Такие подтвержденные случаи действительно задокументированы. Описан вполне конкретный физиологический механизм, например у пациентов с трансплантированной почкой. Находясь на вынужденной иммуносупрессии, они сталкивались с развитием опухоли (порой даже с метастазами) в пересаженном органе. Но стоило скорректировать или отменить иммуносупрессивную терапию, как иммунитет восстанавливался и опухоль полностью исчезала, причем как ее первичные очаги, так и метастазы. То есть триггером исцеления становилось возвращение нормальной функции иммунной системы

— Можно ли в таком случае обобщить, что рак — это всегда следствие сбоя в иммунитете?

— Я стараюсь избегать подобных обобщений и категоричного слова «всегда». Безусловно, при развившейся опухоли мы констатируем патологию локального или системного иммунного ответа, когда организм не распознает и не уничтожает аномальные клетки. Но утверждать, что это первопричина любого рака, нельзя, ведь мы регулярно видим развитие агрессивных опухолей у абсолютно здоровых людей среднего возраста, не имеющих сопутствующих патологий: тяжелых инфекций, ожирения, диабета или признаков приобретенного иммунодефицита.

— Что больше всего удивило вас за годы работы в области исследования рака?

— Когда я, будучи еще студентом, пришел в эту специальность, меня поразила сама по себе возможность изучать и воспроизводить онкологические заболевания человека в лаборатории. Но самое удивительное для меня сегодня — это безграничное разнообразие доступных методов: от 3D-моделей и микрофлюидики («опухолей на чипе») до сложных систем in vivo. Этот арсенал можно расширять и конструировать бесконечно, создавая новые точные инструменты для практической онкологии.

— Но между лабораторной моделью и реальной опухолью в организме человека все равно остается огромная пропасть?

— Безусловно. Любая модель — это всегда всего лишь модель. Ограничения есть везде. В компьютерных моделях in silico погрешности выше, в моделях in vivo — ниже, но они тоже существуют.

Мы создаем опухоль в искусственно индуцированных, неестественных условиях, часто в организме другого биологического вида. Это принципиально отличается от спонтанного возникновения рака у человека. Об этом ограничении экспериментатор должен помнить всегда.

— Если взглянуть на проблему возникновения рака глобально: когда на Земле появились первые раковые клетки? Одновременно с первыми живыми организмами или позже?

— Рискну предположить, что злокачественные опухоли появились одновременно с возникновением многоклеточных организмов, то есть около 2 млрд лет назад. Рак встречается практически у всех многоклеточных животных, за редчайшим исключением вроде гидр. Он присущ млекопитающим, птицам, рептилиям, рыбам.

— Известно, что от него страдали даже динозавры.

— Да, палеопатологические исследования их костных остатков это неопровержимо доказывают. Опухоли обнаруживают даже у насекомых и самых примитивных рыб! Так что для запуска этого процесса природе не требовалось усложнять организм до уровня человека.

Рак — это оборотная сторона самой базовой функции многоклеточной жизни: клеточного деления, которое неизбежно сопровождается ошибками копирования. Если в одноклеточном мире бактерия с критической ошибкой в ДНК просто погибает, то в многоклеточном организме трансформированная клетка может выживать и размножаться за счет ресурсов макроорганизма. Это и есть опухоль.

— Вы совмещаете научную деятельность и руководство крупным институтом, при этом имеете еще и дополнительное бизнес-образование. Что для вас сейчас наиболее актуально в профессиональном плане?

— Перед нашей управленческой и научной командой стоит масштабный вызов. С одной стороны, мы стремимся воссоздать ту эффективную систему полного цикла разработки лекарственных препаратов, которая исторически существовала в Советском Союзе на базе НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. С другой стороны, мы обязаны поднять этот процесс на принципиально новый методический, технический и, главное, концептуальный уровень.

Наша амбициозная задача — сделать институт ведущим центром экспериментальной онкологии как минимум в Восточной Европе.

Интервью проведено при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ

Все фотографии в материале: Елена Либрик / «Научная Россия»