Чтобы пережить холод, организмы используют разные молекулярные механизмы защиты от замерзания. Один из таких способов — синтез антифризных белков, которые препятствуют росту кристаллов льда. Ученые Института химической биологии и фундаментальной медицины им. Д. Г. Кнорре СО РАН исследовали такой белок у сибирского жука-усача Rhagium mordax и выяснили, что для его работы важна способность молекул объединяться в комплексы. Работа опубликована в Scientific Reports.
Наиболее характерные комплексы антифризного белка в воде (красный) и во льду (голубой). Источник фото: Владимир Коваль
Многие виды, обитающие в регионах с холодными зимами, вынуждены переживать значительные перепады температур. Поскольку клетки содержат большое количество воды, при отрицательных температурах возникает риск ее кристаллизации. Кристаллы льда повреждают клеточные мембраны и другие внутриклеточные структуры, что может привести к гибели организма. За миллионы лет эволюции разные виды выработали собственные способы защиты от замерзания.
Один из способов защиты — синтез антифризных белков. Они препятствуют кристаллизации воды: связываются с зарождающимися кристаллами льда и не дают им расти. Благодаря этому жидкости организма могут оставаться в переохлажденном состоянии даже при температуре ниже 0 °C, не превращаясь в лед. Сегодня известно множество антифризных белков, обычно они встречаются у арктических и антарктических рыб и насекомых.
Директор ИХБФМ СО РАН доктор химических наук Владимир Васильевич Коваль: «В основном мы работали с белками арктических рыб, но сейчас исследуем антифризный белок сибирского жука-усача. Такие белки уже применяют в самых разных областях. В медицине их добавляют в растворы для хранения органов, тканей и клеток при низких температурах, чтобы при охлаждении не образовывались кристаллы льда, которые могут повредить ткани. В пищевой промышленности, например в США, их используют при производстве некоторых видов мороженого: они не дают формироваться крупным кристалликам, благодаря чему продукт дольше сохраняет нежную текстуру. Кроме того, ученые исследуют возможность использовать принцип действия этих белков для создания покрытий, защищающих от обледенения, например для передних кромок крыльев самолетов».
На первом этапе антифризный белок выделяют непосредственно из организма. Если его ген уже известен, дальше работать гораздо проще. Его вместе с носителем — плазмидой — подселяют в клетки-продуценты (E. coli или дрожжи). Эти клетки начинают синтезировать нужный белок, что позволяет получать его в больших количествах для дальнейших исследований.
Основная трудность при изучении таких белков — определение их структуры. Обычно для этого используют рентгеновскую кристаллографию, однако антифризные белки плохо кристаллизуются. Поэтому ученым приходится использовать другие методы исследования.
Владимир Коваль: «Здесь особую роль играет аминокислота треонин. Мы обнаружили, что треонины расположены группами и образуют характерные кластеры, которые участвуют во взаимодействии белка с водой. В начале работы нас интересовал вопрос, как такой небольшой белок вообще может эффективно связываться с поверхностью воды и препятствовать образованию льда. Оказалось, что дело не только в его строении, но и в способности объединяться в более крупные комплексы — мультимеры. То есть в растворе белок существует не в виде отдельных молекул, а образует группы из нескольких. Именно в такой форме он значительно эффективнее взаимодействует с водой и выполняет свою антифризную функцию».
Этот вывод удалось подтвердить двумя независимыми подходами. Сначала ученые показали существование мультимеров с помощью атомно-силовой микроскопии. В таком микроскопе поверхность буквально ощупывается очень тонким зондом, кантилевером, благодаря чему можно увидеть отдельные белковые частицы и определить их размер. Полученные изображения продемонстрировали, что белок действительно существует не в виде одиночных молекул, а образует комплексы. Существование мультимерных форм белка доказали также с помощью белковой масс-спектрометрии.
Затем результаты были подтверждены с помощью компьютерного моделирования. Модели показали, что наиболее устойчивы комплексы примерно из восьми молекул белка. Ученые смоделировали их взаимодействие с водой и увидели, как мультимерная структура образует большое количество водородных связей с молекулами воды.
Компьютерное моделирование позволяет воспроизводить природные процессы и наблюдать за тем, как ведут себя молекулы. Для небольших частиц такие расчеты относительно просты, но белок — более сложная система: тысячи атомов одновременно взаимодействуют друг с другом и с окружающей средой. Поэтому ученые используют молекулярную механику — метод, в котором атомы условно представляют как упругие частицы и рассчитывают силы их притяжения и отталкивания. При моделировании нужно учитывать и воду, окружающую белок. Ее молекул гораздо больше, чем молекул самого белка, поэтому описывать каждую из них отдельно слишком затратно по времени моделирования. Вместо этого воду представляют как среду с определенными физическими свойствами, включая плотность и диэлектрическую постоянную. С помощью компьютерного моделирования исследователи построили больше сотни вариантов комплексов из четырех-восьми молекул белка, чтобы понять, какие формы стабильны в растворе.
«Дальше мы хотим развивать исследования антифризных белков, особенно у рыб. При этом сравнить разные типы структур: например, бета-складчатые белки, где водородные связи формируют определенную организацию на поверхности, и альфа-спиральные, которые взаимодействуют с водой совсем иначе. Очень хочется использовать возможности ЦКП СКИФ, ведь структурные исследования белков — одна из ключевых задач для синхротронных установок. Будем надеяться, что вскоре у нас появится возможность проводить такие исследования», — добавляет Владимир Коваль.
Автор: Ирина Баранова
Информация и фото предоставлены Управлением по пропаганде и популяризации научных достижений СО РАН
Источник фото: Владимир Коваль
