Ученые исследовали два вида люцифераз — ферментов, которые содержатся в клетках светящихся бактерий и отвечают за излучение света. Синтезированные в лабораторных условиях белки люциферазы применяются в различных тест-системах, с помощью которых можно проверять почву, воду, пищевые продукты на токсичность. Работа выполнена специалистами подведомственных Минобрнауки России Сибирского федерального университета (СФУ) и Института белка РАН.
Люциферазы активно используют в биосенсорных системах, чувствительных к присутствию токсичных или оказывающих определенный биологический эффект веществ в образцах почвы, воды и пищевых продуктов. Если свечение люциферазной реакции ослабевает, это означает наличие в пробах загрязняющих примесей. Люциферазы бактерий делятся на несколько видов: так называемые «быстрые» и «медленные» в зависимости от скорости реакции светоизлучения. Первые уже используются в биотестах благодаря яркому свечению, а свойства «медленных» продолжают изучаться, чтобы в дальнейшем найти им практическое применение.
«Зарубежные коллеги изучают медленные люциферазы, чтобы применять их для «подсветки» живых клеток человека и животных. Например, такие биологические «фонарики» помогут визуализировать активность работы отдельных генов в клетке или проследить, как функционируют целые ферментативные каскады (цепь последовательных реакций, в которой продукт каждой предыдущей реакции стимулирует и расходуется в следующей реакции). Визуализация активности работы генов осуществляется при помощи генов-репортеров. Их встраивают в одну генетическую конструкцию совместно с интересующим геном. Использовать люциферазы в качестве репортёров удобно, так как по интенсивности свечения, улавливаемого специальными приборами, можно узнать, много ли синтезировалось интересующего белка, при этом не вмешиваясь в жизнь клетки. В нашей Лаборатории биолюминесцентных биотехнологий традиционно используются быстрые люциферазы, чтобы делать экспресс-тесты на безопасность питьевой воды, воздуха, почвы, а также продуктов питания, например, овощей и фруктов. В этот раз мы решили узнать, как поведут себя эти белки двух видов при высоких и низких температурах – сохранят ли активность и смогут ли восстановить свою структуру, если произойдут обусловленные температурой повреждения», — рассказала соавтор исследования, кандидат физико-математических наук, старший преподаватель кафедры биофизики, научный сотрудник Научно-исследовательской части СФУ Анна Деева.
С точки зрения биофизиков, такой эксперимент полезен, чтобы расширить линейку уже использующихся люцифераз. Если светящиеся белки покажут «работоспособность» в жаре или на холоде, тесты на их основе можно будет использовать в полевых условиях, в том числе на сельскохозяйственных участках и возле природных источников воды во всех регионах России. На данный момент в лабораторных условиях люциферазы используют только при комнатной температуре 25°C.
Для проверки активности бактериальных люцифераз при температурах от 5 до 45°C ученые провели ряд лабораторных экспериментов, используя методы остановленного потока (для исследования быстрых реакций) и дифференциальной сканирующей калориметрии (для оценки стабильности белка при нагревании).
В частности, белки на пять минут помещали в камеру, где поддерживалась определенная температура, и затем проверяли, испускают ли они световой сигнал в ходе ферментативной реакции. Белки ожидаемо начинали денатурировать (терять структуру) при высоких температурах, что негативно сказывалось на свечении. Также эксперты провели эксперименты с уже денатурировавшим белком, отмечая перспективы его восстановления в «рабочее состояние».
«Если белок денатурировал при 45–50°C, то при комфортной температуре 20°C он начинает обратный процесс ренатурации (восстановления структуры). Наша задача состояла еще и в том, чтобы узнать, насколько восстанавливается способность люциферазы к свечению в такой ситуации. Мы все отлично знаем, что, например, сваренный белок куриного яйца нельзя вернуть в исходное жидкое состояние, но в нашем эксперименте работа идет с раствором, в котором концентрация белка не так уж велика. Действительно, белковые цепочки могут соединяться друг с другом при высоких температурах, и это мешает им ренатурировать при возвращении к комфортной температуре. Однако этот процесс все же идет, и белки бактериальной люциферазы в большинстве случаев вновь обретают активность», — продолжила Анна Деева.
В результате выяснилось, что «быстрые» люциферазы лучше всего функционируют при 10-20°C, а «медленные» — при температуре до 35°C, демонстрируя в реакции менее яркое свечение, но большую устойчивость к экстремальным для белка условиям. Кстати, именно «теплолюбивостью» объясняется способность медленных люцифераз работать «подсветкой» в живых организмах, поддерживающих постоянную температуру (у человека 36.6°C, у животных до 39.5°C).
Как отмечают авторы, полученный результат для бактериальной люциферазы в условиях «температурных качелей» интересен для фундаментальных и прикладных целей. С точки зрения фундаментальной науки будут и дальше исследоваться особенности влияния высоких температур на денатурацию «светящихся» белков и механизмы их возвращения к изначальной структуре. Прикладные же функции быстрых люцифераз — такие как способность светиться при температурах от 10°C и восстанавливать свою структуру при 20°C, открывают новые перспективы для экспресс-тестирования на токсичность. По мере развития портативных приборов проверять с их помощью воду, почву и урожай можно будет практически повсеместно — на полях, в лесах и на приусадебных участках.
Исследование прошло при финансовой поддержке Минобрнауки России, Правительства Красноярского края и Красноярского краевого фонда науки, его результаты опубликованы в одном из международных изданий.
Источник информации: пресс-служба Минобрнауки России
Источник фото: ru.123rf.com
