Ученые Сектора молекулярной генетики клетки Лаборатории ядерных проблем Объединенного института ядерных исследований изучают, как действует особый белок тихоходок, который защищает этих уникальных существ от радиации, на модельные организмы — плодовую мушку и культуру клеток человека. В перспективе такие исследования могут помочь в разработке эффективных методов защиты живых организмов, в том числе человека, от ионизирующего излучения.
Изображение 1. Результаты облучения линий D. Melanogaster, экспрессирующих Dsup, и контрольных групп. Кривыми показана выживаемость особей после облучения. Черные кривые — контрольные линии; красные кривые — линии, экспрессирующие Dsup
Тихоходки — это микроскопические, не более 1,5 мм, беспозвоночные животные, которые смогли заселить практически все биомы на Земле, в том числе те, которые принято считать экстремальными для выживания. Эти животные в состоянии анабиоза могут выживать как минимум 30 лет без пищи и воды (более длительные эксперименты пока не проводились). Их сопротивляемость радиации — радиорезистентность — рекордная среди всех живых организмов на Земле: некоторые виды тихоходок выдерживают дозу ионизирующего излучения до 10000 грей. Для сравнения, смертельная доза излучения для человека всего 3-5 грей. Именно поэтому тихоходки стали модельным организмом для изучения возможностей живых организмов сопротивляться радиации.
Прорыв в исследованиях тихоходок произошел в 2016 г., когда японскими учеными был расшифрован геном самого радиорезистентного вида тихоходок Ramazzottius varieornatus. В ходе сравнения генома этих тихоходок со всеми уже известными геномами других организмов был обнаружен уникальный белок, который назвали Damage suppressor, или сокращенно Dsup.
В Объединенном институте ядерных исследований уже ведутся работы по изучению влияния радиации, и особенно космического излучения, на когнитивные функции и морфологические особенности живых организмов. Результаты неутешительные — это влияние разрушительно, и это уже поставило под вопрос возможность дальних космических полетов. Надежда на изучение функций Dsup, что в перспективе может дать нам способ снизить пагубные последствия радиации. Возможно, этот белок позволит повысить уровень радиорезистентности организма, или защитить окружающие опухоль ткани при радиотерапии, или выступить в качестве ДНК-протектора при длительной криоконсервации биологических материалов. Ученые ЛЯП ОИЯИ изучают механизмы действия белка Dsup, чтобы оценить перспективы его использования для повышения радиорезистентности многоклеточных сложных организмов. Посвященный этой тематике научный проект стартовал в институте в январе прошлого года. До этого подобное исследование проводилось лишь на культуре клеток человека HEK293 в Японии с использованием рентгеновских лучей.
В качестве исследуемых объектов ученые ЛЯП ОИЯИ выбрали плодовых мушек Drosophila melanogaster и культуру клеток человека HEK293 — человеческую эмбриональную почку. Благодаря исследованиям, проведенным в Японии, последовательность гена, который кодирует белок Dsup, уже была известна, и специалисты ЛЯП произвели его химический синтез. После этого ген был полностью секвенирован и оптимизирован под используемый объект. “В Лаборатории была совершена микроинъекция раствора, содержащего нужную ДНК, в эмбрионы дрозофил, — рассказывает начальник сектора молекулярной генетики клетки ЛЯП ОИЯИ Елена Кравченко. — Из эмбрионов выросли взрослые особи с необходимой генетической вставкой, которая теперь передается следующим поколениям”. После такой процедуры специалисты получают огромную популяцию плодовых мушек со встроенным геном Dsup, с которого в каждой клетке организма синтезируется белок Dsup.
Чтобы понять, как новые линии дрозофил переносят радиацию, образцы были облучены гамма-квантами с энергией 1-10 МэВ в дозе 500 грей на ускорителе Микротрон МТ-25 в Лаборатории ядерных реакций ОИЯИ. И результаты показали увеличение радиорезистентности у особей с встроенным в ДНК белком Dsup (изображение 1).
Клетки HEK293 облучались на Фазотроне ЛЯП протонами в дозе 4 Гр с энергией 150 МэВ. Как видно на изображении 2, выживаемость клеток, экспрессирующих Dsup, значительно выше, чем у клеток контрольной линии.
Таким образом, ученые ОИЯИ смогли доказать, что белок Dsup работает в ДНК и плодовых мушек, и в культуре клеток человека HEK293, то есть обладает универсальностью. Исследование также показало, что радиорезистентность повышается при воздействии разных видов излучения.
Однако остается немаловажный вопрос — как этот белок влияет на другие системы организма. Для этого специалисты ЛЯП ОИЯИ выполнили транскриптомный анализ, то есть, по сути, проверили активность всех генов, вовлеченных во все биологические процессы дрозофилы.
Выяснилось, что больше 1000 генов, вовлеченных в важнейшие процессы организма, изменили свою активность. Например, снизилась активность генов, вовлеченных в организацию хроматина, регуляцию транскрипции, функционирование нервной системы и т.д., т.е. снизилась активность процессов, связанных с “обслуживанием” ДНК и считыванием информации с нее. Это значит, что необходимо найти способ избежать подобных негативных последствий использования Dsup. По словам специалистов ЛЯП ОИЯИ, в проведенных экспериментах этот ген работает постоянно с очень высокой активностью, в течение всей жизни особи. Поэтому возможным решением проблемы может стать функция включения и выключения этого гена. Для этого возможно настроить работу гена Dsup таким образом, чтобы он включался и выключался при добавлении определенного вещества и работал только в нужное время, например, во время космического полета. Проверка этой гипотезы — одна из следующих целей научной команды этого исследования.
Изображение 2. Результаты облучения линий клеток HEK293, экспрессирующих Dsup, и контрольных групп
Научная группа проекта также работает над определением структуры белка Dsup, чтобы детально понять механизм его действия. Эта задача потребовала синтезировать Dsup в больших количествах, что заняло у коллаборации ученых ЛЯП и ЛНФ несколько месяцев. В результате специалистам удалось приблизиться к пониманию вторичной структуры (трехмерной формы локальных сегментов белков) Dsup с помощью таких методов, как малоугловое рентгеновское рассеяние SAXS (исследования велись в ЛНФ ОИЯИ, российском МФТИ и ESRF, Гренобль, Франция), малоугловое нейтронное рассеяние SANS, динамическое рассеяние света DLS (ЛНФ ОИЯИ). Так, установлен размер белка (примерно 200 на 66 ангстрем). Также доказано, что он не глобулярный (т.е. полипептидные цепи не свернуты в глобулы), и для него показано присутствие вторичной структуры.
Для уточнения вторичной структуры Dsup ученым будет необходимо провести измерения с помощью методов кругового дихроизма, DLS и SAXS в нативных и денатурирующих условиях, когда проверяется нарушение структуры под действием различных факторов. Такие эксперименты уже запланированы на 2023 год с использованием установок ЛНФ ОИЯИ (XEUSS 3.0) и МФТИ (J-1100 CD Spectrometer). Еще одной задачей на следующий год станет оценка метаболической активности и индукции апоптоза (программируемая клеточная гибель) в клетках культуры человека HEK293, экспрессирующих Dsup, а также определение уровня клеточного кислорода.
Информация и фото предоставлены пресс-службой Объединенного института ядерных исследований
Источник фото: Сектор молекулярной генетики клетки, ЛЯП ОИЯИ
