Ученые ФИЦ Биотехнологии РАН выяснили, как созданные ими «клетки-долгожители» справляются с перегрузкой при производстве белков. В отличие от обычных клеток, которые при сильном стрессе снижают активность и могут погибнуть, «долгожители» масштабно перестраивают обмен веществ, системы защиты от стресса и внутриклеточного транспорта. Понимание этих механизмов поможет создавать более устойчивые и продуктивные клеточные фабрики для производства биофармацевтических препаратов. Результаты исследования, поддержанного грантом Российского научного фонда (РНФ), опубликованы в журнале International Journal of Molecular Sciences.
Экспериментальная установка для культивирования клеток яичника китайского хомячка в суспензионных условиях. Источник: Надежда Орлова
При активном производстве секретируемого белка, например, антитела, эндоплазматическая сеть клеток испытывает повышенную нагрузку, в ней белки должны правильно свернуться, образовать дисульфидные связи и пройти контроль качества. Если система не справляется, клетка включает защитную программу – ответ на несвернутые белки, так называемый стресс эндоплазматического ретикулума. При слишком сильном стрессе этот ответ может закончиться остановкой синтеза белка и гибелью клетки.
Исследователи лаборатории биоинженерии клеток млекопитающих ФИЦ Биотехнологии РАН сравнили два ранее созданных ими промышленных продуцента терапевтических белков на основе клеток яичника китайского хомячка (CHO). Один из них, HB8, был получен на основе стандартных клеток CHO-S и производит хорионический гонадотропин человека. Второй, DUL73, создан на основе линии CHO-4BGD, в которой генетически отключен основной путь направленной клеточной смерти (апоптоза) и усилены механизмы выживания клеток. Этот продуцент секретирует аналог дулаглутида – препарата, применяемого в терапии сахарного диабета 2 типа.
Для моделирования сильного стресса системы созревания секретируемых белков клетки обрабатывали дитиотреитолом (DTT), нарушающим образование дисульфидных связей, а затем анализировали изменения транскрипции генов.
В HB8 после воздействия изменялась экспрессия 404 генов, а в устойчивом к апоптозу DUL73 – 1019, что примерно в 2,5 раза больше. При этом 222 гена составляли общее ядро стрессового ответа и во всех случаях изменялись в одном направлении. В продуцентах белков с отключенным процессом апоптоза особенно активно перестраивались системы транспорта аминокислот, обмена глутатиона и поддержания окислительно-восстановительного баланса, а также внутриклеточного транспорта мембранных пузырьков.
Следует отметить, что существенные различия между продуцентами существовали и до индукции стресса: DUL73 уже исходно отличался повышенной активностью ряда систем стрессового ответа, контроля качества белков и аутофагии.
«Клетки яичника китайского хомячка с генетически отключенным внутренним путем апоптоза не просто дольше не погибают, у них по-другому организованы системы поддержания протеостаза (белкового гомеостаза) – правильного сворачивания, созревания и удаления поврежденных белков, а при стрессе они гораздо масштабнее перестраивают метаболизм, оксилительно-восстановительный баланс и внутриклеточный транспорт. Для нас особенно важно, что транскриптомный анализ позволяет увидеть конкретные узкие места и выбрать новые гены-мишени для геномного редактирования. Следующий шаг – создание новых вариантов клеток CHO, еще лучше приспособленных к интенсивному синтезу и секреции терапевтических белков», — комментирует к.б.н. Надежда Орлова, научный сотрудник лаборатории биоинженерии клеток млекопитающих ФИЦ Биотехнологии РАН, руководитель гранта РНФ.
Полученные данные уже позволяют наметить направления дальнейшей геномной инженерии CHO-клеток. Среди потенциальных мишеней – системы доставки синтезируемых белков в эндоплазматический ретикулум, образования дисульфидных связей, контроля качества и удаления неправильно свернутых белков, а также внутриклеточного везикулярного транспорта.
Последовательное редактирование этих систем может стать основой для создания нового поколения более устойчивых и продуктивных клеточных фабрик для биофармацевтического производства.
Информация и фото предоставлены пресс-службой ФИЦ Биотехнологии РАН
Источник фото: Надежда Орлова, ФИЦ Биотехнологии РАН
