Сотрудники кафедры химической энзимологии совместно с коллегами из Дюссельдорфского университета имени Генриха Гейне (Германия) при помощи методов генной инженерии впервые в мире соединили ферменты цитохром P450 BM3 и формиатдегидрогеназу в большую активную молекулу. Супермолекула оказалась намного активнее, чем система из двух отдельных ферментов. Работа опубликована в журнале Scientific Reports.

Tishkov_all_4K

Ферменты – белковые молекулы, ускоряющие биохимические процессы в живых системах. Ферменты значительно превосходят синтетические химические катализаторы в избирательности и эффективности. Поэтому биохимики всесторонне изучают принципы действия ферментов и активно используют их в биотехнологических процессах в медицине, фармацевтике и парфюмерии.

«Очень часто в природе и в технологических процессах необходимо использовать сразу два фермента, поэтому добавляют их смесь, – рассказывает один из авторов работы д.х.н., профессор химического факультета МГУ Владимир Тишков. – Продукт реакции после действия первого фермента становится исходным веществом для процесса, проводимого вторым ферментом. Но так как для проведения реакции нужно совсем немного ферментов, то они находятся далеко друг от друга. Получается, что продукту первой реакции трудно найти в смеси второй фермент, что существенно снижает эффективность процесса».

Эффективность двухстадийной реакции можно повысить, если соединить два фермента в одну конструкцию. Тогда они точно окажутся рядом, а путь от изменяемого вещества одного фермента до другого станет минимальным. Сократив путь между активными центрами ферментов, можно повысить каталитическую активность системы на порядок, что позволит уменьшить количество используемых ферментов. Учитывая их высокую стоимость, можно смело говорить о серьёзной экономии для всего процесса.

«То, что сближение ферментов ускоряет катализ, было описано еще в 1990-х годах на примере закрепления двух ферментов на поверхности носителя, – пояснил Владимир Тишков. – Однако в этом случае невозможно достичь правильной взаимной ориентации как между ферментами, так и по отношению к носителю. Развитие методов генной инженерии позволило перевести процесс на более качественный уровень, направленно создавать гибридные молекулы с оптимальной ориентацией».

В исследовании авторы решили использовать монооксигеназу CYP102A1 ВМ3 из группы цитохром P450 оксидаз, отвечающих за гидроксилирование многочисленных соединений в организме. Именно эта группа ферментов отвечает за утилизацию чужеродных для живых организмов химических веществ. Использованный фермент представляет собой большую молекулу, состоящую из 1200 аминокислот, что более чем в 3 раза превышает количество аминокислот в среднем у ферментов и значительно осложняет работу с ней.

«Наши коллеги из Дюссельдорфского университета – мировые лидеры по работе с этим ферментом, – рассказал Владимир Тишков. – Для катализа реакции гидроксилирования с помощью P450 ВМ3 требуется восстановленная форма кофермента NADPH, стоимость которого очень высока, а наша научная группа много лет успешно работает с формиатдегидрогеназой. Этот фермент катализирует окисление формиат-иона до углекислого газа и при этом переводит окисленную форму кофермента NADP+ обратно в NADPH. Поэтому совместное использование формиатдегидрогеназы и цитохрома Р450 ВМ3 очень сильно увеличивает эффективность всего процесса и значительно снижает его стоимость».

В исследовании авторы изучили две возможности присоединения формиатдегидрогеназы к цитохрому: спереди и сзади. Выяснилось, что место контакта играет очень большую роль, так как напрямую влияет на ориентацию активных центров ферментов и определяет общую каталитическую активность молекулы-гибрида. Результаты показали, что по сравнению с отдельными ферментами полученная молекула работала гораздо эффективнее: скорость реакции возрастала в 5-20 раз в зависимости от окисляемого соединения.

«Когда мы выяснили, с какого конца лучше соединять ферменты, пришла пора понять оптимальную длину и аминокислотный состав соединительного мостика между ними, – рассказал соавтор исследования, к.х.н. Павел Паршин (кафедра химической энзимологии химического факультета МГУ). – Для этого в 2019 году по линии DAAD (Немецкой службы академических обменов) я работал в Дюссельдорфском университете и выяснил, что эти параметры практически не влияют на активность фермента. Поэтому мы использовали самый простой вариант соединения».

«Моей частью исследования стал эксперимент по получению гибридных конструкций, - рассказала соавтор исследования, д.х.н. Анастасия Пометун (химический факультет МГУ, «ФИЦ Биотехнологии» РАН). – Планирование, подбор условий получения такой большой и сложной молекулы – это непростая техническая задача. При этом молекула все равно получилась в активной форме и отлично работала. В этой части работы большая помощь была оказана Фондом имени Александра фон Гумбольдта. Фондом была предоставлена трёхмесячная стипендия, в рамках которой мы смогли приехать в Дюссельдорфский университет и инициировать эти исследования».

Как говорят авторы работы, полученную систему ещё можно доработать. Но открытая методика позволяет соединить между собой множество различных ферментов, что представляет огромный научный и коммерческий интерес.

Ссылка на статью: nature.com



Информация и фото предоставлены пресс-службой МГУ