Вальтер, сын известного немецкого психиатра Карла Фридриха Флемминга, выучился на врача и во время франко-прусской войны 1870—1871 годов служил в этом качестве в армии. После победоносного для Германии окончания войны Вальтер Флемминг сначала стал преподавателем медицины в Пражском университете, затем — профессором анатомии в университете Киля, где и проработал до самой смерти. Согласно сохранившимся свидетельствам, студенты любили его за мягкий и миролюбивый характер.
В историю Флемминг вошел прежде всего как один из пионеров цитогенетики — науки о генетическом материале живых клеток. Окрасив клетки анилиновыми красителями, он обнаружил в них нитевидные структуры, которые теперь мы называем хромосомами. В память об этом комплекс ДНК, РНК и белков, из которого состоят хромосомы, цитологи и сегодня называют «хроматином», от греческого слова «цветной» — как и предложил Вальтер Флемминг.
Он также подробно изучил разделение хроматина во время деления клеток, для какового процесса предложил название «митоз» (также прижившееся). Наблюдал Флемминг и амитоз — процесс деления клетки простым разделением ядра надвое, без сложных процессов в хроматине. Свои наблюдения Флемминг обобщил и изложил в своей изданной в 1882 году книге «Внутренняя структура клетки, ядро и деление клеток» (Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung), которая в цитологии по праву считается одной из основополагающих.
Что же касается самого термина «хромосома», то его предложил в 1888 году другой немецкий биолог, Генрих Вальдейер, который изучил эти важнейшие структуры клетки более подробно.