Коллектив ученых из Сколтеха, научного центра LIFT и ФЦМН ФМБА разработал капсулы, которые доставляют и по команде лазера высвобождают белки внутри нервных клеток. Так, у учёных появилась возможность точно воздействовать на отдельные клетки, в том числе на глубине нескольких сотен микрометров. В дальнейшем разработка может стать основой для адресной клеточной терапии повреждений головного и спинного мозга. Результаты опубликованы в журнале Nature Scientific Reports.
Наши клетки взрослеют вместе с нами: по мере развития они приобретают определённые свойства и функции, например, нейральные клетки-предшественницы могут стать нейронами или вспомогательными клетками глии. Этот процесс называется дифференцировкой. Какой путь выберет клетка, зависит от сигналов, которые она получает. В организме эти параметры строго регулируются: важны и состав набора сигнальных белков, и их концентрация, и момент воздействия на клетку.
Этот принцип лёг в основу одного из подходов клеточной терапии: незрелые стволовые клетки превращают в клетки нужного типа, а затем используют их для восстановления повреждённых тканей. Например, при травмах головного или спинного мозга нервную ткань можно вырастить в лаборатории и заместить ею повреждённые участки. Но чтобы получить ткань со сложным строением и функциями, необходимо очень точно регулировать сигналы, которые получают клетки. Стандартные способы введения сигнальных белков не обеспечивают нужной пространственной и временной точности. Белок действует сразу на все клетки в ткани, тогда как каждая отдельная клетка в системе должна получать свой набор стимулов в своё время.
Учёные разработали способ доставки сигнальных белков, который позволяет управлять развитием клеток по отдельности. Белок помещают внутрь небольших частиц с полимерной оболочкой диаметром около 1,7 мкм. Они эффективно захватываются клетками, хорошо удерживают белок и не наносят вреда даже в большом количестве. Далее частицы «открывают» лазером и высвобождают белок прямо внутри клетки.
У технологии есть и платформенный потенциал: в капсулы можно загружать различные белки, а значит, один и тот же подход подойдёт для решения различных задач. Платформа поможет изучать, как клетки нервной системы взаимодействуют и развиваются, а в перспективе может применяться для адресной терапии повреждений центральной нервной системы.
Например, терапия травмы спинного мозга: при ней повреждаются нейроны, и у человека нарушаются двигательные функции. В спинном мозге взрослого человека есть собственные клетки-предшественницы, но после травмы они в основном превращаются в глию и лишь изредка в нейроны. Поэтому перспективной стратегией лечения считают направленное развитие этих клеток в нейроны: так можно восполнять утраченные нейроны без пересадки чужих клеток и ускорить реабилитацию пациентов с травмой спинного мозга.
Исследователи синтезировали капсулы с уникальным строением. Их оболочка состоит из нескольких слоев полимеров (полиаллиламина и полистиролсульфоната) с встроенными золотыми наностержнями и флуоресцентными красителями. Под действием видимого света наностержни нагреваются, а красители образуют активные формы кислорода. Это помогает разрушить полимерную оболочку капсулы и высвободить заключённый белок внутрь клетки.
«Уникальность многослойных полиэлектролитных капсул состоит в том, что технология их получения применима для различных биомакромолекул — белков и нуклеиновых кислот, а функциональность самой капсулы меняется за счет добавления наночастиц или функциональных молекул в оболочку. Капсулы хорошо захватываются клетками, благодаря чему становится возможной «микрохирургия», когда необходимое вещество высвобождается внутри клеток. Но самое главное преимущество разработки в том, что учёный может воздействовать только на определенные клетки в популяции, просто инициируя выпуск инкапсулированного белка в отдельных клетках и отслеживая изменения», — прокомментировал профессор, директор Центра био- и медицинских технологий Сколтеха, научный директор LIFT Глеб Сухоруков.
Исследование проводили на культуре предшественников нервных клеток, развитие которых направляли в сторону нейронов. В капсулы помещали два сигнальных белка: нейротрофический фактор мозга BDNF и транскрипционный фактор NeuroD1. После поглощения клеткой частицы разрушали с помощью лазера видимого света. Далее капсулу облучали повторно, с большей мощностью, благодаря чему краситель в такой капсуле необратимо менял цвет. Это позволило маркировать клетки с разрушенными капсулами и следить за ними в ходе эксперимента.
Следующим шагом учёные проверили подход на нейросфероидах — плотных агрегатах нейральных клеток-предшественниц. Для более глубокого воздействия они использовали ближний инфракрасный свет: он проникает в ткани на большее расстояние и меньше рассеивается. Особый интерес у исследователей вызвала возможность двухфотонного возбуждения, этот подход позволяет облучать только очень малый объём в фокусе лазера, например, воздействовать всего на одну клетку или даже её часть, в том числе внутри трёхмерных образцов. Так, удалось запустить высвобождение белка в клетках на разной глубине нейросфероида, не затрагивая соседние клетки.
Воздействие сигнальных молекул на клетки авторы оценивали по количеству и длине отростков, характерных для нейронов и их предшественников. В экспериментах с капсулами, содержащими BDNF, число клеточных отростков увеличилось. В случае NeuroD1 у клеток увеличилось ветвление отростков, кроме того их фенотип стал напоминать ранние нейроны.
В обоих случаях эффект ограничивался облучённой областью, не влияя на соседние клетки. Это позволяет в перспективе создавать культуры с разным клеточным составом и изучать их взаимодействие при формировании нейронных сетей.
«Мы продемонстрировали возможность объединить доставку белков к нейральным клеткам (как вовне, так и внутри) с долговременным их отслеживанием за счет фотопереключения микрокапсул. Полученная система поможет проследить судьбу единичных индуцированных клеток как в монослойных, так и в сложных многоклеточных комплексах», — прокомментировал первый автор работы Иван Смирнов, стажёр-исследователь Центра нейробиологии и нейрореабилитации имени Владимира Зельмана Сколтеха, аспирант программы «Науки о жизни» в Сколтехе.
Разработанные капсулы объединяют в одной системе адресную доставку белков, управление моментом и местом их высвобождения, а также долговременное маркирование клеток. Для двух белков с разными механизмами действия, BDNF и NeuroD1, показано, что высвобождение по сигналу лазера вызывает локальную дифференцировку клеток-предшественниц в облученной области культуры, а само высвобождение белка возможно в отдельных клетках.
Источник информации: Сколтех
Источник фото: 123rf.com
