До недавнего времени считалось, что нанотехнологии – вотчина ученых, простого человека мало интересует, что происходит в нанолабораториях. Однако в последние годы новые веяния стали все глубже проникать в нашу повседневную жизнь, и вот уже на рынке появляются лекарства, косметические средства и биодобавки с содержанием наночастиц. Как и в случае любого другого новшества, первым делом возникает вопрос: какому риску мы себя подвергаем и насколько это безопасно? Разобраться нам поможет аспирант и сотрудник Курчатовского института, ведущий инженер по метрологии Управления метрологии и сертификации нанонехнологий и продукции наноиндустрии Анна Александровна Анциферова.
Нанозагадки
– Действительно, нанотехнологии за последние 10-15 лет прочно вошли в повседневную жизнь человека. Наночастицы используются в различных отраслях индустрии, в том числе в пищевой промышленности, фармакологии, медицине, косметологии, входят в состав широко используемых биологически активных добавок, гигиенических и упаковочных средств. В этой связи необходимо исследовать воздействие этого нового вещества на организм человека. Кроме того, наночастицы отличаются по своему действию от объемных веществ.
Поясню. У наночастиц соотношение площади поверхности к объему оказывается весьма велико, в то время как у макроскопических объектов оно гораздо ниже. Эта особенность приводит к появлению новых уникальных свойств наночастиц – прежде всего их высокой проникающей способности. Наночастицы могут попадать в клетки через поры клеточных мембран, которые значительно превышают их по размеру. Еще один путь - различные механизмы эндоцитоза. Это, во-первых, фагоцитоз, т.е. питание клетки, во-вторых – пиноцитоз, т.е. захват клеткой жидкости. Рецептор клеточной мембраны также может связываться с веществом-лигандом, и затем происходит конформационный переход молекулы по типу «ключ - замок». В конечном итоге вещество оказывается во внутриклеточном пространстве. Такой механизм сформировался в процессе эволюции, чтобы обеспечить клетки организма необходимыми для их развития веществами. Таким образом, наночастица может попадать в клетку специфическим способом. Она с кровотоком передвигается от органа к органу, преодолевает естественные барьеры организма и может проникать внутрь клеток тканей.
СПРАВКА
Анна Александровна Анциферова – ведущий инженер по метрологии Управления метрологии и сертификации нанотехнологий и продукции наноиндустрии, аспирант и сотрудник НИЦ «Курчатовский институт». Сфера научных интересов: нанобезопасность, физика конденсированного состояния, биология, этнография.
Отдельный, очень интересный вопрос: изучение влияния размеров наночастиц, формы, кристаллической и химической структур на их свойства. Как при этом могут меняться свойства наночастиц при воздействии на организм?
– Чем это опасно?
– Мировые исследования показывают, что наночастица, попавшая внутрь мембраны, может приводить к нарушению метаболизма клетки, к другим изменениям. Мы приходим к тому, что нанотехнологии могут быть потенциально небезопасными, поэтому требуется проведение тщательной токсико-гигиенической экспертизы наночастиц. Это новая проблема, и мы сейчас только начинаем исследования в области нанобезопасности. В связи с этим необходимо развивать дальнейшие исследования по биокинетике, транспорту наночастиц, по изучению способности преодоления различных гистогематических барьеров
Пока остаются неясными также вопросы о механизме взаимодействия наночастицы с клеткой, о причинах, вызывающих нарушения метаболизма и другие изменения в клетках. Непонятно, что происходит с самой наночастицей: разлагается она в клетке, деградирует или нет. Нам могут помочь некоторые существующие методы детектирования наночастиц, с помощью которых можно узнать, как наночастицы ведут себя при попадании в организм.
– Что это за методы?
Первый метод – это просвечивающая электронная микроскопия. Лабораторным мышам и крысам дают корм с наночастицами, затем образец их ткани помещается в эпоксидную смолу и нарезается микротомом на очень тонкие слои. Вся эта пробоподготовка занимает около месяца, поэтому получить удовлетворительные значения для концентрации наночастиц в этом случае достаточно сложно. Необходимо проанализировать большое количество срезов, осуществить трудоемкую и длительную пробоподготовку, после этого провести измерения на микроскопе. И нет никакой гарантии, что мы обнаружим наночастицы.
Этот метод скорее годится для фиксации на наличие, детектирование наночастиц, для предварительного исследования того, проникают ли наночастицы в определенные органы или клетки, а не для оценки концентраций. Такие работы уже проводятся, наша группа в настоящее время тоже в них участвует. Мы рассматриваем различные области головного мозга: гипоталамус, гиппокамп, мозжечок для детектирования наночастиц серебра. Просвечивающей микроскопией мы тоже пользуемся, но это все-таки не универсальный метод.
Другой метод – масс-спектрометрия – требует тоже достаточно длительной и сложной пробоподготовки. Тем не менее он дает более точные оценки концентрации.
Наиболее прецизионные и представительные - ядерно-физические методы: нейтронно-активизационный анализ, метод радиоактивных индикаторов и нейтронно-радиационный анализ.
Нейтронно-радиационный анализ используется, но он пока находится в стадии развития в перспективе исследований биокинетики наночастиц. Мы проводили работы, используя нейтронно-активационный анализ и метод радиоактивных индикаторов. В последнем случае мы радиоактивно метим наночастицы. Появляются определенные изотопные метки, с помощью которых мы можем следить за круговоротом этих наночастиц в организме животного.
– Что дает этот метод по сравнению с микроскопией?
Прежде всего, бо́льшую точность, более полный контроль. И он не требует практически никакой пробоподготовки. Кроме того, метод позволяет оценивать концентрации наночастиц в тех веществах, которые постоянно присутствуют в организме и участвуют в его жизненно важных функциях.
– То есть мы все равно получаем статический снимок. А есть ли метод наблюдения в динамике?
– К сожалению, в любом случае в той или иной мере нужно вмешиваться в процессы метаболизма животного. Возможно, для этого могут быть применены некоторые способы томографии, но мы пока оставили этот вопрос открытым для своих исследования. Работа нашей группы сфокусирована в основном на ядерно-физических методах.
– В чем различие методов нейтронно-активационного анализа и метода радиоактивных индикаторов?
– В случае метода радиоактивных индикаторов мы метим эту наночастицу изотопом, и она остается в организме животного. После этого мы определяем концентрацию таких наночастиц, основываясь на том, что массовое содержание наночастиц пропорционально активности искомого элемента. В свою очередь его активность определяется гамма-спектрометрически.
В случае нейтронно-активационного анализа мы можем проводить работы не в лабораториях, имеющих сертификат, необходимый для проведения этих работ, требующийся даже при работе с дозами ниже минимально значимой активности. Для этого подходят обычные лаборатории, не требуется специальных разрешений, особых мер по защите здоровья персонала. При использовании нейтронно-активационного анализа возможно произвести разделение труда между различными лабораториями, имеющими свою специфику.
После этого мы облучаем образцы тканей в канале ядерного реактора, при взаимодействии с нейтронным излучением рождаются изотопы с теоретически предсказанным временем жизни и сечением реакции. По активности этих изотопов на гамма-спектрометре мы можем увидеть линии этих веществ и оценить их активность. После этого производится оценка концентрации изучаемого элемента. При этом мы облучаем экспериментальный образец вместе с эталонным образцом, содержащим известное количество вещества, и таким образом сравниваем активности и, соответственно, массовое содержание.
Конечно, для проведения подобных работ недостаточно обычного лабораторного оборудования, используются различные ускорители – источники высокоэнергетических частиц.
Собственными силами
– Какие работы по нанобезопасности проводятся непосредственно в Курчатовском институте?
– В Курчатовском институте исследования в области нанотехнологий вышли на новый этап с 2007 г. по инициативе нашего директора Михаила Валентиновича Ковальчука. Естественно, с началом таких исследований возникла проблема нанобезопасности. В мировой практике эта проблема относится к области Environmental andHealth Safety – защиты окружающей среды и здоровья человека от вредного воздействия некоторых объектов, в том числе нанообъектов.
– Какие вредные воздействия уже обнаружены?
– Если говорить о работах нашей группы, следует отметить интересный, не предсказанный ранее результат: эффект накопления наночастиц серебра в головном мозге, который мы обнаружили на основе ядерно-физических методов. Сейчас мы проводим дополнительные исследования на просвечивающем электронном микроскопе, чтобы выявить локализации наночастиц серебра в той или иной области мозга. Важно, что наночастицы серебра при длительном, хроническом приеме способны накапливаться в головном мозге, при этом было установлено, что они плохо из него выводятся.
Наночастицы, попадая в головной мозг, преодолевают гематоэнцефалический барьер, образованный клетками-астроцитами, глиальными клетками. Вероятно, низкая степень выведения наночастиц серебра из головного мозга обусловлена некоторыми особенностями гематоэнцефалического барьера. Чем дольше животное принимает препарат коллоидного серебра, тем медленнее потом выводятся наночастицы, и эффект накопления становится более выраженным.
Мы проводили такие исследования на примере биологически активной добавки коллоидного раствора наночастиц серебра «Арговит-С». Как оказалось, эти частицы, стабилизированные поливинилпирролидоном при пероральном введении, накапливаются в мозге и степень их выведения крайне низка. Если мышь принимает препарат в течение двух месяцев, после одного месяца выведения этих наночастиц путем отмены препарата в мозге остается порядка 94% от первоначального содержания наночастиц при кормлении. При этом наблюдается практически полное вымывание серебра из печени и крови.
Кроме того, проводились работы по изучению прохождения плацентарного барьера и барьера молочной железы этими же наночастицами в экспериментах на лактирующих и кормящих крысах. Как оказалось, через плацентарный барьер может проникать достаточное количество препарата, а барьер молочной железы и вовсе практически прозрачен для наночастиц. Таким образом, при употреблении нанопрепарата при лактации потомство тоже получает наночастицы, которые могут накапливаться в организме.
– Чем чревато это накапливание?
– Этот вопрос до конца не изучен, хотя пионерские работы с наночастицами серебра нами были проведены. Как было показано, при проведении экспериментов в темно-светлой камере мышь изменяет свое поведение, если она принимала нанопрепарат серебра. Мыши, которые получали этот препарат в течение месяца, абсолютно не реагируют на яркий свет и становятся более активными. Контрольная группа ведет себя естественным образом, предпочитая темную часть камеры. Таким образом, прием препаратов наносеребра может повлиять на поведение.
Наличие любого вещества, которое попадает в клетку и не выводится оттуда, может иметь определенные последствия. Пока еще рано говорить, к чему это может привести, проведено еще недостаточно исследований.
– Получается, что препараты с наночастицами, несмотря на то что они недостаточно изучены, уже используется?
– В настоящее время практически не существует нормативных документов, регулирующих нормы потребления наночастиц человеком, они находятся в стадии формирования. Например, наночастицы диоксида титана входят в состав белой краски, используемой в производстве оболочки для витаминов, которые мы ежедневно употребляем.
Диоксид титана обладает способностью поглощать ультрафиолет. Благодаря этому свойству он входит в состав солнцезащитных кремов. Как было установлено в работах отечественных и зарубежных исследователей, правда, в исследованиях in vitro, фототоксический эффект наночастиц диоксида титана может вызывать онкологические заболевания кожи. Мы проводим исследования in vivo, на живых организмах (а in vitro – это исследования на клеточной культуре).
Наша группа также изучает другие широко используемые неорганические наночастицы. Но мы не рассматриваем фуллерены, нанотрубки, которые оказывают сильное воздействие на иммунитет человека, его защитные функции. Органические наночастицы, попадая в организм, приводят к включению защитных функций организма и выработке антител, действуя как антиген и вызывая воспаления. Мы рассматриваем неорганические наночастицы в связи с тем, что каждая наночастица требует уникального подхода, а органика не дает изотопов с удовлетворительными характеристиками. Необходимо сформировать методику для мечения наночастиц, учитывающую ее особенность, подобрать необходимое ионизирующее излучение. В случае диоксида титана подходят как быстрые протоны, так и быстрые нейтроны. Медленные тепловые нейтроны не подходят для этого типа наночастиц в связи с тем, что в данном случае у нас получается один короткоживущий изотоп и один слишком долгоживущий изотоп. Для проведения эксперимента такие изотопы весьма неудобны. Мы уже проводили подобные эксперименты с быстрыми протонами в 2013 г. В случае с наночастицами серебра наиболее подходящим оказывается ядерный реактор –медленные тепловые нейтроны с энергией порядка кТ.
Необходимость в изучении свойств наночастиц возникла в связи с их обширным применением - и, как оказалось, небезосновательно.
– Вы говорили, что эти методы позволяют определить концентрацию наночастиц в клетке. А как изучаются именно токсичные свойства наночастиц?
– Проводятся исследования морфологии органов, но в этом участвуют биологи и медики. Я больше разбираюсь в физике этого явления. Исследованием токсичности занимается токсикология. Эксперименты проводятся в основном на клеточных культурах, особенно в мировой практике.
– Как обстоят дела с оборудованием и ресурсами?
– В Курчатовском институте есть все необходимое оборудование для проведения таких экспериментов. Это нейтронный реактор, различные ускорители, в том числе циклотрон – источник протонов, на котором при бомбардировке бериллиевой мишени можно получить и быстрые нейтроны.
В настоящий момент в Курчатовском институте по инициативе М.В. Ковальчука сформированы ресурсные центры, которые включают в себя различные лаборатории, приборы. Этим оборудованием может воспользоваться любой сотрудник института, достаточно подать заявку в электронном виде на проведение того или иного эксперимента. Ресурсные центры начали работать с конца 2014 г., и мы ждем хороших результатов от новой системы. У нас уже есть пример Центра коллективного пользования в МГУ, который обеспечивает функционирование различных лабораторий.
Яд или панацея?
– После исследований на мышах и крысах будут проводиться исследования на приматах как промежуточный этап?
- В этом нет необходимости. Для экстраполяции данных, полученных из экспериментов с лабораторными грызунами, существует система переноса этих данных на человека с учетом его физиологических особенностей.
– Существует ли механизм воздействия наночастиц на раковые клетки? Есть ли перспектива в этом направлении у наночастиц?
– Конечно. В основном для этой цели используются наночастицы золота. Они в связи со своей инертностью при помощи механизма векторной доставки могут подходить к онкологическим клеткам и с помощью термического воздействия наночастицы золота способны их разрушать. Подчеркиваю, сначала необходимо осуществить направленную доставку наночастиц золота к раковым клеткам, а после этого их термически обработать. Конечно, есть перспективы, и нанотехнологии используются в настоящее время для этой цели. При этом необходимо учитывать вероятный риск применения нанопрепаратов.
Возможно, в каких-то случаях они были бы наиболее простым способом устранения определенных заболеваний. Например, наночастицы золота могут лечить опухоль желудка, но при этом накапливаются в почках. Пациент должен быть осведомлен и о вредном воздействии, и о положительном эффекте наночастиц. Требуется популяризация научных знаний по проблеме нанобезопасности. В мире проводится большое количество конференций по нанотоксикологии, в них есть секция Risk Assesment.
– То есть наночастицы не могут распознавать, где раковые клетки, которые нужно атаковать, а где хорошие клетки, которые трогать не следует? Куда их доставят, там они и будут воздействовать?
– Для доставки наночастиц и обеспечения их проникновения в клетку существуют биологические векторы. Более того, недавно было обнаружено свойство тропности наночастиц к определенным тканям. Благодаря этому особенно актуально терапевтическое действие наночастиц. Проводятся эксперименты по лечению различных бактериальных заболеваний наночастицами серебра. Серебро в отличие от многих антибиотиков не обладает мутагенностью к различным штаммам. Бактерии могут «приспособиться» к некоторым антибиотикам, и тогда они потеряют лечебное воздействие. Наночастицы же серебра практически в любом случае оказывают лечебное воздействие, от которого бактерии гибнут.
При этом примерные предельно допустимые концентрации, о которых мы можем на данный момент говорить, для прокариот оказываются гораздо ниже, чем для эукариот. Мы с вами эукариоты, а бактерии – прокариоты, они гибнут при воздействии этих наночастиц при более низких концентрациях, вызывающих минимальный токсический эффект на организм донора. Применение наночастиц в различных отраслях индустрии, таким образом, приносит несомненную пользу, но необходимо учитывать и все сопутствующие риски.
Подготовил Виктор Фридман
