Мощный новый метод, сочетающий в себе расширенную микроскопию с решетчатой световой микроскопией, использовался для наноразмерной визуализации нейронных цепей мух и мышей и их молекулярных компонентов и действовал примерно в 1000 раз быстрее, чем другие методы, - пишет sciencedaily.com со ссылкой на Science.
Руйсюань Гао и Шох Асано хотели использовать микроскоп своей команды на образцах мозга, увеличенных в четыре раза по сравнению с их обычным размером - надутых, как воздушные шары. Они использовали химическую технику для увеличения мелких образцов, чтобы ученым было легче видеть молекулярные детали.
Методика, называемая экспансионной микроскопией, хорошо работала на отдельных клетках или срезах тонкой ткани, которые можно увидеть с помощью обычных световых микроскопов, но команда из лаборатории Бойдена в Массачусетском институте хотела отобразить значительно большие куски ткани. Они стремились увидеть полные нейронные схемы, охватывающие миллиметры или больше. Ученые нуждались в микроскопе, который был бы высокоскоростным, с высоким разрешением и относительно мягким - не разрушал бы образец, прежде чем они могли закончить его визуализацию.
Тогда они обратились к физику Эрику Бетцигу из Университета Калифорнии в Беркли. Его команда в Исследовательском кампусе Janelia HHMI использовала решетчатый световой микроскоп для визуализации быстрой субклеточной динамики чувствительных живых клеток в 3D. Сочетание двух методов микроскопии потенциально могло дать быстрые, детальные изображения широких участков мозговой ткани. Бетциг пригласил Гао и Асано опробовать микроскоп.
«Я собирался показать им», - смеется Бетциг. Однако вместо этого он был поражен сам: «Я не мог поверить в качество данных, которые я видел».
Бетциг и его коллеги объединились с группой Бойдена и отобразили весь мозг плодовой мухи и участки мозга мыши толщиной с кору. Их комбинированный метод обеспечивает высокое разрешение с возможностью визуализации любого желаемого белка - и все это происходит быстро. Получение изображений мозга мухи в нескольких цветах заняло всего 62,5 часа, по сравнению с годами, которые потребовались бы, если бы использовался электронный микроскоп.
«Мы получаем изображения, по крайней мере, 10 мозгов мух в день», - говорит Бетциг. По его словам, такая скорость и разрешение позволяют ученым задавать новые вопросы, например, как различаются мозги у мужчин и женщин, или как мозговые цепи различаются у мух одного и того же типа.
Группа Бойдена мечтает сделать карту мозга настолько детальной, что вы сможете смоделировать ее на компьютере. «Мы вышли на новый уровень в производительности изображения, - говорит он. - Вот почему мы так взволнованы. Мы не просто сканируем больше мозговой ткани, мы сканируем весь мозг».
Расширяя мозг
Создание детальных карт мозга требует составления схемы его активности и связей - у людей тысячи соединений между более чем 80 миллиардами нейронов. Такие карты могут помочь ученым определить, где начинается заболевание головного мозга, улучшить искусственный интеллект или даже объяснить поведение людей. «Это как святой Грааль для неврологии», - говорит Бойден.
Несколько лет назад у его группы была идея выяснить, могут ли они сделать мозг достаточно большим, чтобы заглянуть внутрь? Добавляя образцы с набухающими гелями – подобно тем, которые используются в детских подгузниках, - команда изобрела способ расширения тканей, благодаря которому молекулы внутри становились менее скученными и их было легче увидеть под микроскопом. Молекулы фиксируются в гелевом каркасе, сохраняя относительные положения после расширения.
Однако было нелегко отобразить большие объемы ткани. Чем толще образец, тем труднее освещать только те части, которые вы хотите увидеть. Слишком сильный свет на образцах может их фотообесцвечивать, сжигая флуоресцентные «лампочки», которые ученые используют для освещения клеток.
Гао говорит, что расширение образца всего в четыре раза увеличивает его объем в 64 раза, поэтому скорость визуализации также становится первостепенной. «Нам нужно было что-то быстрое и без сильного фотообесцвечивания, и мы знали, что в Janelia есть фантастический микроскоп».
Решетчатый световой микроскоп пропускает ультратонкий слой света через образец, освещая только ту часть, которая находится в фокусе микроскопа. Это помогает сфокусированным областям оставаться темными, предотвращая гашение флуоресценции образца.
Когда Гао и Асано впервые проверили свои расширенные ткани мыши на решетчатом микроскопе, они увидели большое количество светящихся шипов, выступающих из ветвей нейронов. Эти кусочки, называемые дендритными шипами, часто выглядят как грибы с выпуклыми головками на тонких шейках, которые трудно измерить. Но ученые смогли увидеть даже «самые маленькие шеи», одновременно получив изображения синаптических белков поблизости, - объяснил Асано.
«Это было невероятно впечатляюще», - говорит Бетциг. Команда была убеждена, что они должны изучать комбинированную технику дальше. «И это то, что мы делаем с тех пор», - добавил он.
Мозг и не только
За последние два года Гао и Асано провели месяцы в Janelia, объединившись с биологами, микроскопистами, физиками и компьютерщиками по всему кампусу для фиксирования и анализа изображений. «Это похоже на сотрудничество на уровне Мстителей», - говорит Гао, имея в виду команду супергероев из комиксов.
Йошинори Асо и команда FlyLight предоставили высококачественные образцы мозга мухи, которые Гао и Асано расширили и использовали для сбора около 50 000 кубов данных по каждому мозгу, создавая своего рода трехмерную головоломку. Эти изображения требовали сложного вычислительного сшивания, чтобы соединить части - эти работы велись под руководством Стефана Заальфельда и Игоря Писарева. «Стефан и Игорь спасли наш бекон, - говорит Бетциг. - Они рассмотрели все ужасные мелочи обработки изображения и работали с каждым набором данных объемом в несколько терабайт».
Затем Сригокул Упадхьяюла из Гарвардской медицинской школы - один из первых авторов отчета - проанализировал объединенные 200 терабайт данных и создал потрясающие фильмы, которые демонстрируют подробности мозга в ярких цветах. Вместе с соавторами они исследовали более 1500 дендритных шипов, изобразили жировые оболочки, которые изолируют нервные клетки мыши, выделили все дофаминергические нейроны и посчитали все синапсы по всему мозгу мухи.
Нюансы техники расширения команды Бойдена делают ее хорошо подходящей для области применения решетчатого микроскопа: техника производит почти прозрачные образцы. Для микроскопа это все равно что смотреть сквозь воду, а не на мутное море молекулярной грязи. «В результате мы получаем кристально чистые изображения с невероятно высокой скоростью в очень больших объемах по сравнению с более ранними методами микроскопии», - говорит Бойден.
Тем не менее проблемы остаются. По словам Бетцига, как и при любой флуоресцентной микроскопии с высоким разрешением, может быть сложно декорировать белки достаточным количеством флуоресцентных «ламп», чтобы их можно было четко видеть с высоким разрешением. А поскольку для расширенной микроскопии требуется много этапов обработки, существует вероятность появления артефактов.
Теперь Гао и команда Janelia строят новый решетчатый световой микроскоп, который они планируют перенести в лабораторию Бойдена в Массачусетском технологическом институте. «Мы надеемся быстро создать карты всей нервной системы», - говорит Бойден.
[Фото: sciencedaily.com, solarseven: ru.123rf.com]
