Волгоградские учёные-биологи из ФНЦ агроэкологии РАН ведут молекулярно-генетические исследования и разработку эффективных методов микроклонального размножения ценных генотипов растений в лабораторных условиях. Актуальность анализа вызвана необходимостью сохранения видового разнообразия биосистем с учетом их географической и локальной популяционной изменчивости

Изменение экологических и климатических условий, антропогенный фактор, выпас скота на заповедной территории становятся причинами снижения численности ценных, редких, краснокнижных видов растений, увеличивающими риск исчезновения и затрудняющими процесс воспроизводства их популяции. В таком случае важная роль отводится биотехнологическим и молекулярно-генетическим аспектам сохранения редкого вида растений: ученые создают генетические банки редких и ценных видов растений и изучают особенности и возможности их культивирования in vitro (в пробирке).

Специалисты ФНЦ агроэкологии РАН (г. Волгоград) ведут исследования по решению проблемы сохранения биоразнообразия и разрабатывают методы для создания искусственных популяций ценных древесно-кустарниковых растений, включая формирование видовых коллекций в лабораторных условиях. Так, сотрудники новой Молодежной лаборатории, применяя метод клонального микроразмножения в культуре in vitro, планируют воспроизвести древесно-кустарниковые хозяйственно ценные виды растений.

Ольга Олеговна Жолобова – кандидат биологических наук, заведующая лабораторией, ведущий научный сотрудник Лаборатории биотехнологий ФНЦ агроэкологии РАН

Ольга Олеговна Жолобова – кандидат биологических наук, заведующая лабораторией, ведущий научный сотрудник Лаборатории биотехнологий ФНЦ агроэкологии РАН

 

Ольга Олеговна Жолобова – кандидат биологических наук, заведующая лабораторией, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологий ФНЦ агроэкологии РАН (г. Волгоград) – рассказала о том, чем вызвана потребность изучения генетических банков растений, о методах проведения генетического мониторинга редких и малоизученных видов, о создании репрезентативной коллекции in vitro, а также о текущем исследовании, основанном на методе микроклонального размножения и проходящем в новой молодежной лаборатории биотехнологий, которую она возглавляет. 

Развитие методов молекулярной генетики и работа по созданию генетических банков растений способствуют сохранению генетического разнообразия редких и исчезающих видов растений.

По замечанию Ольги Жолобовой, «основной задачей научных институтов в сохранении биологического разнообразия является комплексное изучение и сохранение ценных генетических ресурсов природной флоры путем пополнения и поддержания коллекций живых растений (ex situ, т.е. в природе, в естественных местах произрастания), а также разработка эффективных методов сохранения in situ (в культуре, создание специальных питомников, генетических банков хранения материала). Генетические банки подразделяются на несколько видов: полевые генетические банки (чаще всего это клоновые посадки плодовых и лесных пород, корневых и клубневых культур), семенные генетические банки, банки растительного материала в культуре in vitro (культура тканей и клеток растений в условиях замедленного роста)».

Для проведения генетического мониторинга редких и малоизученных видов волгоградским специалистом еще в рамках диссертационного исследования были разработаны RAPD и AFLP-методы мультилокусного анализа.

«Когда речь идет об эффективном сохранении вида, необходимо понимать, насколько широко его генетическое разнообразие в природе. Одним из наиболее рациональных подходов к описанию внутривидового разнообразия является использование молекулярно-генетических маркеров, которые позволяют легко идентифицировать отдельные генотипы и оценить степень генетического полиморфизма внутри отдельных популяций и вида в целом. Поскольку большинство редких видов растений относятся к числу малоизученных в генетическом плане объектов, то для них возможно использование маркеров универсальных для всех видов растений и животных: RAPD и AFLP, ISSR и некоторых других», – пояснила ученый.

Ольгой Жолобовой эти методы ранее были применены для мониторинга популяции Левкоя душистого. Исследователь уточнила, как они работают на практике и что помогают выявить:

«Первым этапом работы при использовании молекулярных методов исследования является получение очищенной геномной ДНК из растительных тканей. Для проведения RAPD-анализа (не требует каких-либо знаний о последовательности ДНК, случайная амплификация полиморфной ДНК) генома Левкоя душистого было использовано 11 десятичленных праймеров, ранее успешно применяемых для маркирования генома пасленовых, злаков и представителей родов Stachys, Syringa и др. Всего проанализировано 40 образцов ДНК из шести популяций M. fragrans етом. При этом популяции различались между собой по уровню выявляемого полиморфизма. С помощью AFLP-анализа (полиморфизм длины амплифицированных фрагментов) также были выявлены различия между популяциями и внутрипопуляционный полиморфизм левкоя. AFLP-анализ также выявил уникальные для каждой популяции амплифицируемые фрагменты ДНК. В RAPD-спектрах выявлено 22 мономорфных фрагмента, в AFLP-спектрах – 28. Ряд общих фрагментов, по-видимому, можно считать маркерами вида.

Сходство результатов, полученных при использовании двух различных методов, говорит о правомерности использования каждого из них по отдельности. В то же время более простая методика проведения RAPD-анализа, большее количество уникальных фрагментов, выявляемых в каждой популяции по сравнению с AFLP-анализом, а также хорошее разделение популяций при статистической обработке результатов RAPD-анализа позволяет сделать вывод о правомерности использования RAPD-метода (несмотря на то, что в последнее время многими исследователями этот метод рассматривается как “морально устаревший”) при генетическом мониторинге популяций Левкоя душистого. С другой стороны, объединение RAPD- и AFLP-методов позволяет более точно оценить генетическое разнообразие и генетические особенности популяций, поскольку характеризует более обширные области генома изучаемого растения».

Как подчеркнула Ольга Жолобова, «проведенная работа дала возможность перевести исследования редких и исчезающих видов растений на качественно новый уровень. Полученные в работе результаты показали высокую внутривидовую генетическую дифференциацию с использованием ДНК-маркеров, что, в свою очередь, позволяет говорить о возможности проведения полномасштабного генетического мониторинга. Исходя из полученных данных, очевидно, что при разработке стратегии сохранения редких видов ex situ отбор и количество образцов целесообразно проводить, опираясь на данные об уровне и характере генетического разнообразия вида в целом, а мероприятия по сохранению отдельных популяций in situ организовывать, проводя предварительный генетический мониторинг с учетом географической межпопуляционной и локальной внутрипопуляционной изменчивости».

Сохранению и воспроизведению редких видов растений способствуют методы биотехнологии, благодаря которым редкие и исчезающие виды растений в культуре in vitro вошли в репрезентативную коллекцию.

«Одним из перспективных направлений, наряду с традиционными способами сохранения растений ex situ, является создание коллекции in vitro редких и исчезающих видов растений. Работы по изучению и сохранению редких видов, занесенных в Красную книгу, проводились на базе лаборатории биотехнологии Волгоградского регионального ботанического сада. Коллекция in vitro состояла из 72 редких видов, принадлежащих к 25 семействам.

В коллекции in vitro представлены виды разных семейств и жизненных форм: прямостоячие кустарники (Calophaca wolgarica, Genista tanaitica Bieb.), полукустарнички (Lepidium meyeri, Silene cretacea, Hedysarum cretaceum), стержнекорневые травянистые поликарпики (Matthiola fragrans, Hedysarum grandiflorum, Astragalus dasyanthus Pall.), короткокорневищные травянистые поликарпики (представители рода Iris L.), луковичные и клубнелуковичные поликарпики (Bellevalia sarmatica (Georgi) Woronow, Allium regelianum A. Beck., Tulipa gesneriana L.).

По эколого-фитоценотическим группам: лугово-степные (Iris aphylla L.), степные (Bellevalia sarmatica, Calophaca wolgarica, Astragalus dasyanthus, Iris pumila L.), галофитно-лугово-степные (Allium regelianum), петрофильно-степные (стенотопные виды – кальцефиты: Hedysarum cretaceum, Lepidium meyeri, Matthiola fragrans, Silene cretacea).

Коллекционный фонд редких и исчезающих видов в культуре in vitro широко был представлен видами различных категорий редкости, относящихся к 25 семействам и разным эколого-фитоценотическим группам. Репрезентативность коллекции дает возможность производить отбор наиболее типичных модельных объектов для проведения экспериментов по подбору оптимальных условий культивирования in vitro», – информировала Ольга Жолобова.

Хранение редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro оценивается и с точки зрения экономической эффективности. Так, волгоградским биологом еще в рамках диссертационного исследования на соискание кандидатской степени была рассчитана стоимость технологии воспроизводства редких видов растений в культуре in vitro.

По словам исследователя, «для этого были произведены расчеты затрат на осуществление полного цикла выращивания редких видов методом микроклонального размножения, начиная от введения в культуру in vitro, этапа микроразмножения, индукции ризогенеза и адаптации регенерантов к почвенным условиям (in vivo). А также затраты на непрерывное поддержание коллекции редких видов, используя метод клонального микроразмножения. При расчете затрат учитывали: уровень мировых цен на аналогичную продукцию, стоимость материальных затрат, фонд оплаты труда и начисления на заработную плату, стоимость коммунальных платежей, стоимость амортизационных отчислений на оборудование.

На основании произведенных расчетов был проведен анализ возможных путей снижения стоимости данной технологии. Это возможно благодаря усовершенствованию имеющихся собственных разработок и использованию зарубежного опыта. Замена дорогостоящих компонентов среды на более дешевые, снижение затрат на расходные материалы, а также повышение квалификации обслуживающего персонала для снижения трудозатрат позволят значительно снизить затраты на готовую продукцию. Значительный экономический эффект дает также прием хранения коллекции in vitro редких видов растений в условиях замедленного роста».

Ольга Жолобова акцентировала, что «данные расчетов позволяют сделать вывод о том, что создание лабораторий по клональному микроразмножению актуально и экономически выгодно как для решения производственных задач, так и для сохранения биоразнообразия».

Так, в январе 2019 года в Федеральном научном центре агроэкологии РАН в рамках инициативы, связанной с национальным проектом «Наука», были созданы две новых молодежных лаборатории, призванные объединить молодых специалистов для научно-исследовательской работы на современном оборудовании в области генетических технологий: лаборатория молекулярной селекции и лаборатория биотехнологий. Большая часть сотрудников (как правило, молодые ученые до 35 лет) – это выпускники вузов по специальностям биоинженерия и биоинформатика. Лабораторией молекулярной селекции руководит к.б.н. Валерий Геннадьевич Зайцев. Здесь ведется работа по изучению технологий работы с геномом растений с использованием современных молекулярно-генетических методов.

Лабораторию биотехнологий возглавила Ольга Олеговна Жолобова. В данный момент под ее руководством коллектив ведет исследование в рамках проекта по государственному заданию «Повышение эффективности микроклонального размножения растений на искусственных питательных средах в условиях in vitro с последующей адаптацией к условиям произрастания», рассчитанному на 3 года (с 2019-2021 гг.). Основная цель ученых – разработка эффективных методов сохранения и воспроизводства древесно-кустарниковых видов в культуре in vitro. По мнению Ольги Жолобовой, «созданная биоресурсная коллекция in vitro древесно-кустарниковых хозяйственно ценных видов растений позволит не только решить проблемы сохранения биоразнообразия, но и при необходимости получить достаточное количество материала для создания искусственных популяций и выполнения работ по интродукции и селекции лесомелиоративных, декоративных, плодовых и лекарственных видов растений».

Растения-регенеранты в культуре in vitro

Растения-регенеранты в культуре in vitro

Фото из архива лаборатории биотехнологий ФНЦ агроэкологии РАН

Слева направо: Скумпия кожевенная  Cotinus coggygria Scop., Сосна крымская Pinus pallasiana Lamb., прорастание семян Робинии псевдоакации   Robinia pseudoacacia L.

Слева направо: Скумпия кожевенная  Cotinus coggygria Scop., Сосна крымская Pinus pallasiana Lamb., прорастание семян Робинии псевдоакации   Robinia pseudoacacia L.

Фото из архива лаборатории биотехнологий ФНЦ агроэкологии РАН

       Сегодня в лесном хозяйстве остро стоит проблема размножения ценных генотипов, гибридов и форм древесных и кустарниковых растений, отличающихся высокой продуктивностью, устойчивостью к абиотическим факторам среды либо другими ценными свойствами. В этой связи семенное размножение не всегда может удовлетворить нужды селекционеров из-за низкого наследственного качества семян, большой генетической неоднородности потомства. Поэтому специалисты лаборатории биотехнологий применяют в своем исследовании метод клонального микроразмножения в культуре in vitro, в основе которого лежит индукция множественного числа побегов при определенных культуральных условиях и строгой асептике и который является перспективным методом вегетативного размножения древесных растений.

Работа в стерильных условиях ламинар-бокса. На фото справа - младший научный сотрудник К.Р. Бикметова.

Работа в стерильных условиях ламинар-бокса. На фото справа - младший научный сотрудник К.Р. Бикметова.

Фото из архива лаборатории биотехнологий ФНЦ агроэкологии РАН

Как обращает внимание Ольга Жолобова, «в настоящее время происходит стремительное сокращение ареалов и полное исчезновение многих видов растений, биологическое разнообразие является основой для поддержания экологических условий существования и экономического развития человеческого общества, а генетические ресурсы являются основным источником селекционно-важных признаков. В связи с этим актуальна проблема сохранения и воспроизводства редких и исчезающих видов растений как in situ, так и ex situ.

Использование системы in vitro (разработка технологии клонального микроразмножения) по сравнению с традиционными методами поддержания коллекций растений имеет ряд преимуществ: высокие коэффициенты размножения; миниатюризация процесса, приводящая к экономии площадей, занятых маточными и размножаемыми растениями; оздоровление посадочного материала от нематод, грибов и бактерий, вызывающих болезни растений; возможность длительного депонирования образцов с меньшими затратами на хранение. В условиях in vitro удается размножить и укоренить те растения, которые трудно размножаются традиционным способом».

Микроклональное размножение помогает усовершенствовать основы сохранения редких исчезающих растений, а совершенствование его технологии отдельных генотипов с учетом их биологических особенностей и факторов культивирования in vitro, по словам заведующей лабораторией, «существенно расширяет возможности биотехнологических методов в системе производства оздоровленного посадочного материала и в селекционном процессе».

Кроме того, в рамках работы Молодежной лаборатории специалисты изучат растения, перспективные для агролесомелиорации, в борьбе с опустыниванием и деградацией земель, такие как Скумпия кожевенная, Сосна крымская, ценные генотипы Робинии псевдоакации (см. фото), а также Джузгун безлистный (Calligonum aphyllum); перспективное растение в борьбе с опустыниванием, хороший пескоукрепитель, Гледичия трехколючковая Gleditsia triacanthos L., ее уникальная форма безколючковая, Карагана древовидная (Caragana arborescens), сорт выведенный в ФНЦ агроэкологии РАН “Несравненная ВНИАЛМИ” и др.

Как отметила Ольга Жолобова, «отобранные формы растений, с устойчивыми к стрессовым условиям аридных зон генотипами, изучаются в лабораторных условиях. Ценные генотипы необходимо не только сохранить, но и добиться устойчивого воспроизводства качественного посадочного материала. Среди практических задач, которые могут быть решены с помощью метода культуры тканей – выявление видов и сортов, устойчивых к стрессам и влиянию абиотических факторов. Создание искусственных селективных систем in vitro позволяет изучать механизмы формирования адаптаций растений как на клеточном, так и на организменном уровне».

Предварительные итоги работы лаборатории биотехнологий следующие: создана биоресурсная коллекция in vitro древесно-кустарниковых хозяйственно ценных видов растений, которая на сегодня насчитывает 17 видов. Специалистами подобраны оптимальные параметры режима стерилизации для получения асептической культуры (стерильной) для изучаемых видов. Изучено влияние сроков изоляции и типов первичного экспланта на регенерацию в культуре in vitro.

По словам Ольги Жолобовой, «древесные растения являются сложными объектами для культуры in vitro. Все типы тканей и органов у них сильно заражены грибами и бактериями, что значительно затрудняет обеспечение асептики эксплантов. Поэтому одним из наиболее трудоемких этапов микроклонального размножения древесных растений является этап введения в культуру in vitro. Успех работы на данной стадии зависит от множества факторов, среди которых – выбор первичного экспланта, подбор оптимального режима стерилизации, возраст растения-донора, влияние сезонности на регенерационную способность эксплантов и влияние генотипических особенностей на регенерацию в культуре in vitro в целом».

Волгоградскими биологами всесторонне изучаются все тонкости процесса введения в культуру in vitro.

«На этапе микроразмножения и укоренения растений в культуре in vitro осуществляем подбор оптимальных концентраций физиологически активных веществ и минерального состава питательной среды, которые влияют на динамику развития регенерантов, коэффициент размножения и индукцию ризогенеза. Для некоторых видов уже определены данные параметры. Темпы развития эксплантов при культивировании разных видов существенно отличаются. Поэтому подбор оптимальных концентраций компонентов питательной среды для каждого вида осуществляется индивидуально. При этом фиксируем следующие параметры роста и развития регенерантов в культуре in vitro: коэффициент размножения, линейный рост побегов, процент витрифицированных побегов, темпы развития регенерантов в зависимости от количества субкультивирований, изменения в морфологии побегов (длина междоузлия побегов, размеры листьев и их форма). В результате анализа экспериментальных данных разрабатывается методика микроклонального размножения отдельных видов древесно-кустарниковых культур», – резюмировала заведующая лабораторией биотехнологий и ведущий научный сотрудник ФНЦ агроэкологии РАН Ольга Жолобова

Таким образом, изучение генотипа редких, ценных и исчезающих растений позволит сберечь эти уникальные виды, а в дальнейшем выработать практические рекомендации по разработке стратегии и проведению разного рода мероприятий по сохранению отдельных популяций в разных регионах страны.