Ученые физического факультета МГУ с российскими и бельгийскими коллегами разработали новый светящийся генетически кодируемый белок HyPerFLEX, яркость флуоресценции которого зависит от концентрации перекиси в клетке, а цвет может быть настроен при помощи внешних флуорогенов. Пероксид водорода является продуктом дыхательного процесса эукариотических клеток и встроен в множества сигнальных цепочек управления метаболизмом.
Созданный индикаторный белок демонстрирует высокую чувствительность и селективность к перекиси, обладая при этом высокой стабильностью к перепадам кислотности, что впервые позволило проследить за окислительным стрессом в эндоплазматическом ретикулуме клетки. Двухфотонная флуоресцентная микроскопия сдвинутых в красную спектральную область белков позволила впервые визуализировать динамику изменения перекиси в нейронах глубоких слоев мозга мыши.
Результаты исследования, поддержанного национальным проектом «Наука и университеты», а также Российским научным фондом (грант № 22-72-10044), опубликованы в журнале Nature Chemical Biology.
Перекись водорода (H2O2) — это универсальная сигнальная молекула клетки, которая вырабатывается в ответ на такие стимулы, как факторы роста, гормоны и цитокины, а также участвует в цепи переноса электронов во внутренней мембране митохондрий при дыхании. Благодаря относительно большому времени жизни она действует как вторичный мессенджер, передавая сигналы к чувствительным к окислению мишеням в ядре и другим клеточным компартментам посредством окисления их тиольных групп.
Генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы (ГКФИ) обеспечили значительный прогресс в обнаружении H2O2 в клетках с высоким временным и пространственным разрешением, нацеленным на отдельные клеточные компартменты. Однако до недавнего времени все чувствительные сенсоры были созданы на основе зеленых флуоресцентных белков. Это не позволяло использовать их одновременно в различных органеллах клетки, усложняло комбинирование их с другими сенсорами.
Молекулярной основой нового индикатора послужил флуоресцентный белок FAST, который может присоединять различные флуорофор-подобные молекулы (флуорогены), тем самым изменяя свой цвет. Добавление особого чувствительного молекулярного домена OxyR в специальное место белка cpFAST заставило его изменять яркость свечения в зависимости от концентрации H2O2. Созданный таким образом индикатор HyPerFLEX продемонстрировал высокую чувствительность и селективность, а его стабильность к кислотности среды позволяет работать в самых неблагоприятных условиях. Важнейшей особенностью разработанной молекулярной платформы стала возможность реализовать флуоресцентный индикатор любого оптического диапазона от синего до ближнего инфракрасного (ИК). Благодаря этой особенности впервые был показан транс-компартментный транзит H2O2 в клетке. Сформированная локально в митохондриях перекись была зафиксирована последовательно в цитозоле и ядре при помощи трех различных по цвету сенсоров. Разработанный сенсор являлся важнейшим недостающим элементом для проведения многопараметрических исследований окислительного стресса в живых системах с клеточным разрешением. Потенциал визуализации сенсоров семейства HyPerFLEX в живых тканях ученые раскрыли при помощи многофотонной флуоресцентной микроскопии.
«Биоткани обладают сильным рассеянием, поэтому классические техники визуализации флуоресцентных маркеров в живых животных практически не работают. Разрабатываемые в нашей лаборатории методики микроскопии при двух- и трехфотонном возбуждении белков позволяют понизить рассеяние возбуждающего света и радикально локализовать флуоресцентный отклик. Нами были исследованы двухфотонные спектры возбуждения сенсора HyPerFLEX с различными флуорогенами для их оптимального многофотонного возбуждения. Было показано, что высокая яркость сенсоров HyPerFLEX с красными флуорогенами позволяет следить за динамикой пероксида водорода в нейронах живого мозга мыши на глубинах до 350 мкм», — отметил соавтор исследования, старший научный сотрудник кафедры общей физики и волновых процессов физического факультета МГУ Александр Ланин.
Молекулярные сенсоры H2O2 нового поколения устанавливают новый стандарт в области визуализации окислительно-восстановительных процессов в биологии, сочетая в себе повышенную чувствительность, спектральную гибкость и устойчивость к воздействию окружающей среды, что позволяет более точно визуализировать окислительные сигналы в клеточных компартментах и тканях живых животных в режиме реального времени. Используя взаимодополняющие преимущества этого и других сенсоров, исследователи теперь как никогда ранее имеют возможность отобразить сложную динамику H2O2 и получить новые знания о его разнообразных ролях в здоровом метаболизме и при развитии патологий.
В исследовании приняли участие ученые РНИМУ им. Н.И. Пирогова, ИБХ РАН им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, ФЦМН ФМБА, РКЦ, ЛИФТ Центр, а также Брюссельского центра редокс-биологии.
Информация предоставлена пресс-службой МГУ
Источник фото: ru.123rf.com
