Рождение древесного узора

В центре внимания ученых из КарНЦ РАН образование уникальной древесины карельской березы, известной своим неповторимым декоративным узором. Изучая молекулярно-генетические и физиологические механизмы, биологи открывают возможности регулирования процесса образования древесины, или ксилогенеза. Полученные данные могут быть использованы при разработке рекомендаций для выращивания карельской березы и других древесных растений

Древесина карельской березы по рисунку напоминает мрамор и по праву считается самой декоративной древесиной Севера. Важную роль в формировании ее рисунка играют извилистые очертания годичных колец, темноокрашенные включения различных очертаний и перламутровый блеск. Уже более тридцати лет специалисты из Института леса Карельского научного центра РАН изучают этот уникальный феномен – образование узорчатой древесины карельской березы, выявляют генетическую предрасположенность к ее появлению и исследуют влияние условий среды на степень развития узора древесины.

Наталия Алексеевна Галибина – доктор биологических наук, заместитель директора по научной работе Института леса КарНЦ РАН, руководитель лаборатории биотехнологии растений Отдела комплексных научных исследований КарНЦ РАН (г. Петрозаводск) – рассказала об исследованиях процесса ксилогенеза (образования древесины), в том числе, и аномальной (узорчатой) древесины карельской березы.

Наталия Галибина подробно изложила, почему важно изучение механизмов ксилогенеза древесных растений:

«Древесные растения являются основными продуцентами в лесных экосистемах, а древесина представляет собой важный возобновляемый источник органического углерода. Ускорение роста и улучшение качества древесины, ее технологических свойств – основные задачи современной лесной биотехнологии. Для древесины (ксилемы) характерен широкий спектр составляющих ее структурных элементов ‒ это сосуды (функция водопроведения), трахеиды (основная функция механическая, но участвуют в проведении воды), волокна (механическая функция), клетки паренхимы, образующие радиальные лучи (функции транспорта и запасания питательных веществ). Формирование древесины происходит за счет притока фотоассимилятов из листьев по флоэме. Флоэма (нисходящий транспорт продуктов фотосинтеза) и ксилема (восходящий транспорт воды и растворенных в ней минеральных веществ) образуют проводящие ткани древесного растения. Обе ткани (ксилема и флоэма) образуются в результате деятельности латеральной (боковой) образовательной ткани или меристемы ‒ камбия. Меристемы представляют собой ниши, в которых находятся стволовые клетки, участвующие в процессах роста и регенерации растительного организма. Стволовые клетки – это недифференцированные клетки, способные к симметричному и ассиметричному делению и дифференцировке в разные типы клеток и могут дать начало не только определённой ткани, органу, но и целому растительному организму. При делении такой клетки одна из образовавшихся дочерних клеток остается стволовой, а другая становится предшественницей структурных элементов флоэмы (расположена наружу от стволовой клетки), или элементов ксилемы (расположена внутрь от стволовой клетки). Такие стволовые клетки, которые могут производить клетки и флоэмы, и ксилемы, называются бифасциальными (двухсторонними).

Этапы дифференциации клеток камбия в структурные элементы ксилемы включают рост клеток растяжением, формирование вторичной клеточной стенки, а в случае волокон, сосудов, трахеид ‒ программируемую клеточную смерть (ПКС). В отличие от слабодифференцированных паренхимных клеток, это мертвые клетки, которые состоят только из клеточных стенок. Клеточные оболочки в древесных растениях составляют до 90% от сухой массы. По сравнению с первичной клеточной стенкой, вторичная клеточная оболочка много толще и составляет большую часть целлюлозной биомассы, которая в том числе служит возобновляемым ресурсом для производства биотоплива. Структурные элементы древесины отличаются между собой по составу компонентов их клеточных стенок (целлюлоза, гемицеллюлозы, пектины, лигнин, белки). Соотношение структурных элементов в древесине, состав их клеточных стенок определяют ее физико-механические, технологические, топливные и декоративные свойства. Это очень краткий рассказ о процессах формирования древесины, который необходим для понимания дальнейшего повествования. Важно понять, что поиск путей эффективного управления ксилогенезом (процессом формирования древесины) необходим как с точки зрения повышения продуктивности растений, так и для получения древесины с заданными свойствами».

В последнее десятилетие впечатляющие достижения в клеточной, молекулярной и структурной биологии, как отмечает Галибина, «привели к интегрированному взгляду на образование древесины, начиная с деления клеток в камбии, роста клеток и утолщения клеточных стенок, вплоть до запрограммированной клеточной смерти. Широко распространенными экспериментальными моделями для изучения физиолого-биохимических и молекулярно-генетических механизмов регуляции процесса ксилогенеза является клеточная культура Zinnia elegans L. (Цинния изящная – однолетнее травянистое растение), у которой при выращивании в среде с гормонами (ауксином и цитокинином) клетки трансдифференцируются в трахеальные элементы, и Arabidopsis thaliana (Резушка Таля – модельный организм для изучения генетики и биологии развития растений), у которого типы сосудистых клеток вторичной ксилемы аналогичны типам тополя, но только меньше по размеру и лишены клеток лучевой паренхимы. Понятно, что с травянистыми растениями работать легче, но недавно появились работы, в которых уже на модельном древесном растении – тополе изучают механизмы ксилогенеза».

Во всем мире растет интерес к изучению молекулярных механизмов, регулирующих формирование тканей ствола древесных растений. Интерес «подогревается» и тем, что именно древесные растения играют значительную роль в сохранении климата, «консервируя» углекислоту. Для понимания этих механизмов создают конструкции, в которых одни гены «выключают», а другие заставляют работать активнее (сверхэкспрессируют).

«Особенностью нашего исследования является изучение ксило- и флоэмогенеза у древесных растений в ходе отклонений от нормального роста и развития проводящих тканей. Изучение отклонений от нормы позволяет нам глубже и всесторонней постигнуть механизмы регуляции нормального процесса»,  – комментирует Наталия Галибина, – Сама природа подарила нам уникальный экспериментальный объект – карельскую березу, в стволе которой одновременно протекают два процесса – нормальный и аномальный ксилогенез. Карельская (Betula pendula var. carelica) – это форма березы повислой (Betula pendula var. pendula), у которой формируется только типичная для вида прямослойная древесина. Деревья карельской березы различаются между собой по времени начала и моделям развития узорчатой древесины в онтогенезе. Бывает и такое, что узорчатая древесина формируется только на одной стороне ствола. Представьте – в рамках одного ствола мы можем исследовать "нормальные и аномальные" сценарии роста и развития проводящих тканей, нивелируя тем самым влияние факторов среды».

Чем обоснован выбор темы научного исследования и какова определяющая роль научного наставника Наталия Галибина пояснила:

«К изучению механизмов формирования аномальной древесины я подключилась в 2006 году. Это направление исследований возглавляет доктор биологических наук, Людмила Людвиговна Новицкая. Людмила Людвиговна – признанный специалист в области анатомии и физиологии древесных растений, под ее руководством ведутся работы по изучению структурно-функциональных особенностей формирующихся тканей ствола древесных растений, а также регуляторных взаимоотношений флоэмы, камбия и ксилемы в ходе онтогенетического развития растений. Область моих интересов, в большей степени, сосредоточенна на изучении физиолого-биохимических и молекулярно-генетических механизмов функционирования стволовых клеток камбия, как в норме, так и при формировании структурных аномалий».

 «Можно уверенно утверждать, что на сегодняшний день в Институте леса сложился творческий и, можно сказать, молодежный коллектив, включающий специалистов разных направлений, что позволяет всесторонне подходить к изучению механизмов ксилогенеза. Исследованием анатомо-морфологических особенностей структурных аномалий древесных растений занимаются кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Надежда Николаевна Николаева и научный сотрудник Татьяна Владимировна Тарелкина. Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Юлия Леонидовна Мощенская и научный сотрудник Ксения Михайловна Никерова исследуют различные метаболические пути, протекающие при формировании нормальной и аномальной древесины, изучают гены, регулирующие эти процессы, а также выявляют физиолого-биохимические маркеры разных сценариев ксилогенеза у древесных растений. Полевые исследования, в которых, как правило, принимают участие все члены коллектива, приурочены к активному росту растений (май-июль) и включают описание объектов и условий их произрастания, постановку экспериментов, отбор растительного материала. Органы и ткани древесных растений замораживают в жидком азоте и хранят в низкотемпературных морозильных камерах при -80^оС до проведения анатомических, физиолого-биохимических и молекулярно-генетических анализов. Основную часть этой очень важной работы выполняют ведущие биологи лаборатории физиологии и цитологии древесных растений ИЛ КарНЦ РАН: Подгорная Марина Николаевна, Софронова Ирина Николаевна, Семенова Людмила Игоревна, Иванова Диана Сергеевна», –Галибина отметила значимый вклад своих коллег в работу по изучению механизмов ксилогенеза.

Как происходит образование уникальной текстуры древесины карельской березы? Какие физиолого-биохимические особенности лежат в основе формирования узорчатой древесины?

«Оригинальная текстура древесины карельской березы формируется в результате отклонений в деятельности латеральной меристемы – камбия. В зонах развития структурных аномалий не запускается программа гибели клеток, приводящая к формированию сосудов и волокон ксилемы и ситовидных элементов флоэмы. Камбиальные производные дифференцируются в клетки запасающей паренхимы, которые накапливают большие количества запасных веществ. Среди запасных веществ много фенольных компонентов, которые на спиле проявляются в виде темноокрашенных включений. При этом образующиеся волокна и сосуды имеют неправильную искривленную форму, обеспечивая древесине карельской березы свилеватость и перламутровый блеск. В аномальных участках можно выделить два основных отличия: (1) увеличение количества делений в камбиальной ткани в целом и (2) изменение ориентации деления клеток камбия (они начинают делиться главным образом поперечными и антиклинальными перегородками вместо переклинальных, доминирующих при образовании нормальной древесины березы)», – объяснила ученый

Чтобы понять, как происходит формирование оригинальной текстуры древесины у карельской березы, ученые Института леса КарНЦ РАН изучают метаболические процессы, происходящие в местах формирования структурных аномалий.

Наталия Галибина сообщила об особенностях обменных процессов, наблюдаемых при формировании узорчатой древесины карельской березы:

«Нами впервые было показано, что именно сахароза (основная транспортная форма ассимилятов у березы повислой) играет важную роль в формировании структурных аномалий у карельской березы. Сахароза – химически инертна, для того чтобы она вступила в метаболические процессы необходимы ферменты, которые катализируют ее превращения. Утилизация сахарозы происходит при участии ферментов ее гидролиза – сахарозосинтетазы и инвертазы. Сахарозосинтаза в присутствии уридиндифосфата (УДФ) обратимо расщепляет сахарозу на уридиндифосфатглюкозу (УДФГ) и фруктозу (сахароза + УДФ ↔ УДФ-глюкоза + фруктоза). Несмотря на двойную направленность сахарозосинтазной реакции, в акцепторных тканях, к каким относится камбиальная зона, сахарозосинтаза функционирует, в основном, в направлении распада сахарозы. В ходе ксилогенеза сахарозосинтаза активно включается в метаболизм клеток на этапе отложения вторичной клеточной стенки, регулируя количество УДФ-глюкозы, идущей на синтез микрофибрилл целлюлозы. Данная стадия является одной из наиболее важных, поскольку клеточные стенки составляют основную часть древесной биомассы. Инвертаза катализирует реакцию гидролиза сахарозы до глюкозы и фруктозы (сахароза + Н₂О → глюкоза + фруктоза). Гексозы, образующиеся в ходе инвертазного расщепления сахарозы, могут расходоваться на дыхание, синтез крахмала и компонентов клеточных стенок (целлюлоза, гемицеллюлозы, лигнин и др.), а также выступать в роли сигнальных молекул. Соотношение активностей сахарозосинтазы и разных форм инвертазы определяет преимущественное включение расщепляемой ими сахарозы в те или иные метаболические пути и, как следствие, оказывает влияние на направление дифференциации производных камбия».

Как подчеркивает ученый, специалистами КарНЦ РАН «впервые были выявлены физиолого-биохимические маркеры разных сценариев ксилогенеза (формирование нормальной и аномальной древесины). Формирование нормальной по строению древесины обычной березы, в составе которой преобладают сосуды и волокна, происходит на фоне высокой активности сахарозосинтазы и сопровождается активным синтезом структурных компонентов клеточных стенок. В этих тканях наблюдается высокий уровень экспрессии генов, кодирующих сахарозосинтазу (Sus1,2) и целлюлозосинтазу (Ces3,7,8). Включение сахарозы через сахарозосинтазный путь в синтез целлюлозы приводит к необратимому выводу ее из обмена веществ. В зонах структурных аномалий узорчатой древесины, где преобладает дифференциация производных камбия в паренхимные клетки, активность сахарозосинтазы низкая (снижение экспрессии генов Sus1,2) и уменьшается содержание целлюлозы в ксилеме (уровень экспрессии генов, кодирующих целлюлозосинтазу (Ces3,7,8), снижен). В этом случае метаболизация притекающей по флоэме сахарозы происходит с участием апопластной инвертазы. При этом уменьшение отношения активности сахарозосинтаза / апопластная инвертаза коррелирует со степенью развития структурных аномалий в камбиальной зоне березы повислой.

Высокая активность апопластной инвертазы в узорчатых участках ствола сопровождается интенсивным образованием гексоз, использование которых в реакциях энергетического /пластического обмена может приводить к генерации активных форм кислорода и возрастанию фенольных компонентов, оказывая тем самым влияние на активность ферментов антиоксидантной системы (АОС). В камбиальной зоне у двух форм березы повислой мы исследуем активность следующих ферментов АОС: супероксиддисмутазы, переводящей супероксид-радикал в перекись водорода, каталазы и пероксидазы, участвующих в утилизации перекиси водорода, и полифенолоксидазы, принимающей участие в процессах синтеза лигнина. Мы показали, что формирование узорчатой структуры древесины у карельской березы сопровождается повышением активности ферментов АОС, которые можно использовать в качестве биохимических маркеров узорчатости древесины».

Развитие структурных аномалий узорчатой древесины карельской березы обусловлено взаимодействием многих процессов. В основе нарушения развития камбиальных производных лежат сложные молекулярно-генетические механизмы.

«Один из них – это инактивация гормона ауксина (ИУК) через образование его коньюгата ИУК-глюкоза, нарушение транспорта гормона. У карельской березы важными показателями аномального развития ксилемы являются уменьшение в ней доли сосудов, нарушение их пространственной ориентации и усиленная паренхиматизация ткани. Индуктором дифференцировки сосудов служит ауксин, направление его потоков определяет пространственную ориентацию сосудов. Мы установили, что появление структурных аномалий древесины у карельской березы связано со сверхэкспрессией гена, кодирующего фермент ИУК-глюкозасинтаза, который катализирует реакцию инактивации ауксина путем синтеза его коньюгата ИУК-глюкоза. Показано, что синтез ИУК-глюкоза через цепь биохимических реакций может быть связан с гексозами, которые образуются в апопласте в результате расщепления сахарозы инвертазой клеточных стенок. При этом изменятся локализация на плазмалемме PIN белков, участвующих в транспорте ИУК, результатом чего становится изменение направления транспорта гормона. У карельской березы это находит отражение в нарушенной ориентации сосудов ксилемы. Мы полагаем, что появление "вихрей" и "струй" в узорчатой древесине карельской березы обусловлено именно этими процессами», – разъяснила Наталья Галибина.

С какого возраста и каковы начальные признаки проявления узорчатости карельской березы и в чем причина их изменений?

«Видимые появление признаков узорчатой древесины у карельской березы обычно можно наблюдать в возрасте 4-5 и 7-10 лет, в зависимости от условий произрастания. Наши исследования показали, что уже на ранних этапах развития (до появления видимых отличий) у карельской березы имеют место изменения путей утилизации сахарозы, которые во взрослом состоянии являются индикаторами нарушений в камбиальной деятельности. Показано, что активность ферментов АОС может являться тест-признаком для диагностики аномального ксилогенеза у карельской березы уже на самых ранних этапах онтогенеза», – конкретизирует ученый, –

Мы исследуем деревья обычной (типичная для вида прямослойная древесина) и карельской (узорчатая древесина ствола) березы повислой разного возраста – это и взрослые (40-45-летние) растения, 6-14-летние растения, у которых начинает формироваться узорчатая древесина, а также 2-4 летние сеянцы, выращенные из семян обычной и карельской березы. В лабораторных условиях в камерах при контролируемых температуре и освещенности мы выращиваем сеянцы обычной и карельской березы».

По замечанию Галибиной, «при любом варианте скрещивания родительских форм в потомстве карельской березы появляются особи, как с узорчатой, так и безузорчатой текстурой древесины. Среди опытных деревьев карельской березы мы подбираем экземпляры с высокой степенью узорчатости древесины и растения, у которых признаки аномального строения древесины отсутствовали (безузорчатые растения)».

Большинство исследованных учеными растений произрастает на Агробиологической станции Карельского научного центра, а также на лесосеменных плантациях на территории Республики Карелия. По словам Галибиной, «ареал карельской березы прерывистый. В пределах области естественного распространения она не образует чистых по составу древостоев, а встречается одиночно или группами в смешанных насаждениях с другими лиственными, а иногда хвойными видами деревьев. Диапазон экологических условий, в которых произрастает карельская береза, довольно узок и определяется хорошим освещением, температурным режимом, способствующим интенсивному оттоку сахарозы из листьев, нормальным увлажнением. Почвенные условия и потребности в питательных веществах, в частности соотношение азота и фосфора, непосредственно влияют на рост растений, углеводный обмен, активность ферментов, и как следствие, на формирование древесного узора. Анализ почвы в Кондопожском, Пряжинском и Медвежьегорском районах Карелии показал, что в этих лесах растут карельские березы с различной интенсивностью рисунка».

Как почвенные условия влияют на формирование и качество древесины карельской березы?

«В результате изучения мест естественного распространения карельской березы и анализа характеристик почв в пределах ее ареала Л.Л. Новицкой было высказано предположение, что карельская береза не распространяется как в области очень бедных, так и относительно богатых почв. Наши исследования показали, что большое влияние на проявление признака узорчатости древесины у карельской березы оказывает доступность подвижного азота в почве. В условиях нормального обеспечения азотом формирование узора идет на фоне интенсивного роста (высокие активности сахарозосинтазы и апопластной инвертазы в ксилеме и активность апопластной инвертазы во флоэме). Некоторое снижение плодородия почвы приводит к снижению активности сахарозосинтазы на фоне возрастания активности апопластной инвертазы и сопровождается увеличением количества темноокрашенных включений паренхимы в древесине. При этом морфологические показатели растений не изменяются. При сильном дефиците подвижного азота в почве усиливается конкуренция за фотоассимиляты между формированием узорчатой древесины (процесс связан с усиленной метаболизацией сахарозы по апопластному пути во флоэме) и радиальным ростом ствола (использование сахарозы в ксилеме на формирование клеточных стенок).

Результаты исследования могут быть использованы для объяснения, почему ареал карельской березы не включает плодородные почвы. Под воздействием высокого уровня азотного питания (нитратов) в ксилеме карельской березы снижается метаболизация сахарозы по сахарозосинтазному и инвертазному пути. Первое ведет к уменьшению приростов ксилемы, второе – к снижению в ней содержания паренхимы, т.е. подавлению формирования узорчатой текстуры древесины. В этих условиях сахароза, поступающая из листьев, расходуется во флоэме. Здесь с участием апопластной инвертазы она интенсивно используется в реакциях запасного метаболизма, что поддерживает жизнедеятельность существующих и образование новых клеток запасающей паренхимы. Поэтому отличительной особенностью берез, произрастающих на плодородных почвах, становится толстая кора, а максимальным выражением этих тенденций – появление грубокорых форм березы», – ответила Наталья Галибина.

Таким образом, всесторонние, в том числе, молекулярно-генетические исследования древесных растений учеными КарНЦ РАН представили   новый взгляд на механизмы, лежащие в основе формирования узорчатой древесины.

 По словам карельского ученого, «многолетние исследования членами коллектива насаждений карельской березы в пределах ее естественного ареала и в лесных культурах на территории Карелии позволили получить данные, характеризующие анатомо-морфологические и физиолого-биохимические особенности деревьев с разной степенью проявления аномальности строения древесины. Получен патент на полезную модель «Способ диагностики узорчатой текстуры древесины карельской березы» (Авторами Н.А. Галибиной и К.М. Никеровой). Члены коллектива разработали ряд экспериментальных подходов, целью которых было нарушение у растений обычной березы транспорта сахарозы и, соответственно, создание зон ее избыточного содержания. Получен патент на полезную модель «Способ выращивания древесины с декоративной текстурой» (Авторы Л.Л. Новицкая, Ф.В. Кушнир). Высказана гипотеза о возможной роли повышенного содержания сахарозы в формировании аномальной древесины у карельской березы (публикации в высокорейтинговых журналах).

Благодаря комплексному методическому подходу, включающему выбор уникального объекта, разработку экспериментальных подходов для получения слоев ксилемы и флоэмы с преобладанием в них одного из типов структурных элементов, использованию физиолого-биохимических, молекулярно-генетических методов, создана основа для разработки способов управления ксилогенезом с целью увеличения выхода биомассы древесины и выращивания древесного материала с заданными свойствами. Результаты, полученные в ходе изучения уникального объекта – карельской березы– мы используем в качестве фундаментальной основы для выявления механизмов ксилогенеза у основных лесообразующих пород (сосны и ели)».