Архангельские ученые предложили метод выявления и идентификации трематод в пресноводных улитках без проведения визуального обследования, что поможет оценить паразитарную обстановку в окружающей среде
Брюхоногие моллюски семейства Lymnaeidae, или прудовики, которые обитают повсеместно и, в том числе, на территории Арктики, могут выступать в качестве промежуточного хозяина для определенных видов паразитов. В ходе миграции животных, таких, например, как рыбы и птицы, паразиты распространяются из одного региона в другой. Чаще всего, такими представителями паразитофауны становятся трематоды – класс плоских паразитических червей, насчитывающий несколько тысяч видов. Они являются источником опасных заболеваний у животных и человека. Поэтому новые методы определения паразитов нужны как для сохранения биоразнообразия в целом, так и для обеспечения экологической безопасности арктических территорий.
Специалисты ФГБУН ФИЦКИА УрО РАН (г. Архангельск), исследуя образцы прудовиков в различных районах арктического региона, обнаружили особей, инфицированных партенитами трематод. На основании лабораторных исследований ученые разработали оригинальный способ, на который был получен патент, позволяющий выявить зараженных прудовиков и провести видовую идентификацию паразитов.
Александр Васильевич Кондаков – кандидат технических наук
Сотрудники Института биогеографии и генетических ресурсов Федерального исследовательского центра комплексного изучения Арктики им. акад. Н.П. Лаверова УрО РАН (г. Архангельск) – кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной экологии и биогеографии Александр Васильевич Кондаков и кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Российского музея центров биологического разнообразия Ольга Владимировна Аксёнова – рассказали о результатах исследований трематод в организме пресноводных брюхоногих моллюсков семейства Lymnaeidae и о предложенном авторским коллективом эффективном молекулярно-генетическом методе определения видового состава внутренних паразитов трематод позвоночных и беспозвоночных животных.
Ольга Владимировна Аксёнова – кандидат биологических наук
По мнению Александра Кондакова, «очень часто люди вспоминают про паразитов, когда каким-либо образом заражаются трематодами или обнаруживают их, например, в рыбе, дичи или у сельскохозяйственных животных. Но даже из школьной программы по биологии известно, что трематоды имеют сложный жизненный цикл со сменой промежуточных хозяев, одними из которых чаще всего выступают пресноводные брюхоногие моллюски, которых мы называем прудовиками или в народе просто улитками. И изначально наши исследования были направлены в целом на выявление трематод в прудовиках молекулярными методами. Но в одной из работ мы объединили полученные данные по этим животным в Арктике, т.к. в настоящее время этот вопрос действительно актуален».
«Все мы неоднократно слышали про климатические изменения, которые наиболее ярко проявляются именно в Арктике. Происходящие здесь изменения могут способствовать активизации таких процессов, как увеличение численности паразитов и их переносчиков, частичная или полная замена паразитофауны хозяев, а также проникновение паразитов на новые территории. Многие исследователи все чаще отмечают появление ранее не встречающихся здесь видов животных и растений. Не являются исключением моллюски и развивающиеся в них трематоды, которые получают возможность пройти полный жизненный цикл в наших северных водоемах, а значит в итоге попасть в организм человека или животного. В связи с этим обнаружение и определение видового состава паразитов на арктических территориях имеет большое значение для оценки существующей паразитарной обстановки и прогнозирования её изменений с целью предотвращения заражений», – дополняет ответ коллеги Ольга Аксёнова.
Занимаясь исследованием прудовиков (в настоящее время проанализировано порядка 700 образцов), специалисты обнаружили в их органах и тканях наличие паразитов. Процент инфицирования моллюсков партенитами трематод в среднем составил около 12%, то есть практически каждая десятая особь из исследованных была заражена.
В большинстве своем, как заметил Александр Кондаков, «трематод изучают уже в половозрелом возрасте, когда обнаруживают их в животных. Но есть специалисты, которые изучают полный жизненный цикл паразитов, тогда как раз без прудовиков никак не обойтись. Их (прудовиков) собирают, помещают в емкости с водой и ждут, когда из них выйдут личинки трематод, которых и исследуют, используют для изучения морфологических особенностей и проведения генетических анализов».
Материал для исследования сотрудниками ФГБУН ФИЦКИА УрО РАН был собран в ходе многочисленных экспедиций в разных уголках России: от Мурманской области до Чукотки, а также за рубежом (например, в Китае, Корее и США). Исследования были поддержаны несколькими грантами, в т.ч. грантом Президента РФ № МК-1720.2019.4 «Изучение таксономического и генетического разнообразия брюхоногих моллюсков семейства Lymnaeidae как промежуточных хозяев трематод с применением современных молекулярно-генетических и биогеографических подходов» и продолжаются в рамках проекта РНФ № 21-74-10155 «Пресноводные моллюски России: интегративная таксономия, биогеография, экология и паразитофауна».
Район исследований: красными точками отмечены места сборов образцов прудовиков в ходе экспедиционных исследований
В каком регионе/районе больше всего прудовиков, пораженных трематодами и почему?
«Считается, что трематодозы – заболевания, вызванные трематодами и наиболее распространены в тропических странах, а на территории России встречаются в Сибири и на Дальнем Востоке. Но следует отметить, что не всегда в этом виноваты именно прудовики. Здесь в качестве промежуточных хозяев выступают и другие семейства брюхоногих моллюсков, и связано это больше с природными особенностями регионов, которые способствуют большему разнообразию промежуточных хозяев и благоприятствуют развитию трематод в них. Что касается прудовиков, то пока сложно выделить регионы, где они больше заражены, а где меньше, т.к. исследование начато относительно недавно, но распространены они практически во всех пресных водоемах», – сообщила Ольга Аксёнова.
По замечанию Александра Кондакова, «нет таких регионов, где наблюдается высокое инфицирование прудовиков трематодами. В целом процент инфицированных моллюсков везде около 12%. Исключением являются искусственно подогретые водоемы (каналы-охладители ТЭЦ), в которых моллюсков, инфицированных трематодами, нами обнаружено не было. Возможно, это связано с высокими температурами в этих водоемах, которые трематоды не способны переносить».
Прудовик обыкновенный (Lymnaea stagnalis) в одном из водоемов на юге полуострова Таймыр
Как прудовики переносят в своем организме наличие трематод: болеют, умирают?
«По этому вопросу есть несколько интересных исследований. В одном из которых говорится о том, что при инфицировании моллюска трематодами на ранних этапах развития замедляется его рост и в результате изменяется форма их раковин. В другом же исследовании определено, что трематоды осуществляют химическую кастрацию прудовика, то есть прудовик не может размножаться, продолжая жить и питаться, но при этом не тратит энергию на размножение. Но нужно четко понимать, что не в интересах трематод сильно угнетать промежуточного хозяина, так как они питаются за счет него», – ответил Александр Кондаков.
«Изначально свободноплавающая личинка трематод мирацидий находит моллюска в воде и проникает в его тело, а затем начинает там развиваться и размножаться. Происходит это, как правило, в половой железе или пищеварительной системе моллюска. В конце концов они достигают большой численности и заполняют внутреннюю полость тела моллюска, и это однозначно его угнетает, ослабляет иммунитет, влияет на его активность, поведение и продолжительность жизни. Есть примеры, когда зараженные прудовики достигают невероятно крупных размеров, т.е. трематоды ускоряют его развитие до наступления половозрелости, а затем начинают сами активно в нем развиваться», – продолжила Ольга Аксёнова.
Почему трематоды выбирают моллюсков семейства Lymnaeidae?
«На самом деле трематоды используют в качестве промежуточных хозяев и другие семейства брюхоногих моллюсков. Сказать наверняка, почему они в основном выбирают в качестве промежуточных хозяев именно моллюсков семейства Lymnaeidae, сложно. Просто в нашем исследовании акцент был сделан именно на это семейство, как наиболее распространенное, но недостаточно изученное. Скорее всего это связано с коэволюционными процессами, которые привели к тому, что моллюски оказались оптимальным организмом для прохождения отдельных стадий развития трематод», – прокомментировал Александр Кондаков.
Где преимущественно трематоды обнаружены: на мантии или на внутренних органах прудовиков?
«Трематоды у зараженных моллюсков обычно локализуются во внутренних органах, в пищеварительной системе (гепатопанкреасе), в половой железе (гонаде) и в мышечной ткани (ноге) моллюска. Нередко их можно обнаружить и под мантией, но обычно моллюска нужно вскрыть, чтобы понять, заражен он или нет», – уточнила Ольга Аксенова.
Чем трематоды отличаются от остальных червей и по каким морфологическим признакам?
«Трематоды, или еще их называют сосальщики – это целый класс паразитических плоских червей. Их свыше 2000 видов. Характерной чертой представителей этой группы является сложный жизненный цикл, в котором происходит чередование партеногенетического и гермафродитного поколения в ряду хозяев, так называемая гетерогония. В течение своего жизненного цикла трематоды могут иметь от одного до трех-четырех хозяев. Они инвазируют представителей самых различных систематических и экологических групп наземных, пресноводных и морских позвоночных, вызывая тяжелые, иногда смертельно опасные заболевания у своих хозяев. Что касается морфологических особенностей их строения, то вопрос довольно сложный. Дело в том, что в зависимости от стадии развития и вида трематод, они существенно внешне отличаются.
Схема жизненного цикла трематод рода Diplostomum
Если говорить о взрослой стадии (марите), которую мы обычно можем встретить в мясе или внутренних органах позвоночных животных, в т.ч. и человека, то, соответственно, форма тела у них уплощенная и может быть разной в зависимости от семейства: грушевидная, листовидная или нитевидная. Как правило, на теле у них есть ротовая и брюшная присоски, но опять же не у всех. Размеры их могут варьировать от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров. На стадии свободноплавающей личинки мирацидия до попадания в промежуточного хозяина – например, их тело покрыто чувствительными ворсинками, на стадии церкария – после развития в моллюске, у них вырастает хвостик, который тоже у разных видов может быть нитевидным или раздваиваться на конце, а на стадии метацеркария, когда трематода развивается во втором промежуточном хозяине – хвостик отпадает. Т.е. довольно сложно выделить какие-то четкие признаки, благодаря которым неспециалист бы увидел и с легкостью сказал, что это именно трематода», – детально информировала Ольга Аксёнова.
По словам ученых, наличие трематод в моллюсках свидетельствует о неблагополучной паразитарной обстановке в водоеме или в регионе в целом. Т.е. если трематоды есть в моллюсках, то скорее всего есть и окончательный хозяин, который будет заражен рано или поздно. Это могут быть рыбы, птицы, домашний скот или человек. Чаще всего трематоды расселяются за счет птиц, которые осуществляют перенос паразитов на большие расстояния.
Каков риск заражений ими человека и животных?
«Риск заражения трематодами всегда есть. Для человека источником заражения могут быть сырое мясо или рыба, или можно просто искупаться в водоеме, где есть трематоды. Есть виды трематод, которые способны проникать через кожу, или человек или животное может просто заглотить с водой или растениями их личинки», – отвечает Ольга Аксёнова.
«Есть интересная статистика, отражающая прямую зависимость увеличения потребления сырой рыбы в еду в виде суши и количеством паразитических заболеваний у человека. Поэтому потреблять сырую рыбу и мясо в пищу небезопасно. А животные в меньшей степени защищены от паразитов, чем люди, так как часто питаются растениями и пьют воду непосредственно из водоемов», – сообщил Александр Кондаков.
В современной исследовательской практике для идентификации трематод применяют различные молекулярно-генетические методы. Сотрудники ФГБУН ФИЦКИА УрО РАН разработали и запатентовали оригинальный метод для выявления и идентификации трематод в моллюске без проведения визуального обследования. Таким образом за период исследований было обнаружено 24 вида трематод, относящихся к 12 родам.
Как подчеркивает Александр Кондаков, «методов, которые позволяют определить широкий спектр трематод одновременно, как таковых нет. Разработанный нами метод позволяет выявлять практически всех известных трематод в прудовиках и осуществлять их идентификацию. Это и является преимуществом нашего метода. Он дает возможность на ранних этапах развития трематод независимо от стадии определить их присутствие и видовой состав в пресных водоемах посредством молекулярно-генетического анализа моллюсков, которые выступают для них промежуточными хозяевами».
Алгоритм выявления и идентификации и трематод у моллюсков семейства Lymnaeidae
В чем состоит ваш подход и как вы определяете принадлежность к различным биологическим видам?
«Суть метода заключается в следующем: мы берем образцы моллюсков из водоема, затем в лаборатории выделяем из них ДНК и проводим амплификацию (увеличение числа копий ДНК) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В результате при анализе продуктов, полученных в ходе реакции, мы уже можем увидеть на электрофореграмме заражен моллюск или нет. Грубо говоря, если видим одну полосу на рисунке, то моллюск не заражен, если две и более полос, то моллюск заражен. Если хотим определить вид моллюска и/или трематод, то далее подготавливаем продукт и проводим секвенирование, т.е. прочитав полученные фрагменты ДНК выбранных нами маркерных генов и сопоставив их с имеющейся в международной базе данных «GenBank» информацией, в результате мы узнаем видовую принадлежность интересующих нас образцов», - раскрыл детали авторского подхода Александр Кондаков.
Электрофореграмма с результатами амплификации генетического маркера рибосомной ДНК ITS2
Чем подтверждается надежность и точность вашего метода?
«Надежность и точность нашего метода подтверждается полученными результатами. Полученные нуклеотидные последовательности ДНК как штрих-код позволяют практически безошибочно определить вид, если информация о нем есть в базе или понять, что мы имеем дело с новым, еще малоизученным видом. Такое тоже бывает», – аргументировал ученый.
Где важны полученные молекулярные данные по изучению популяций прудовиков с точки зрения паразитологии? Как эти сведения способствуют пониманию фактического распределения определенных видов трематод?
«Полученные молекулярные данные по прудовикам позволяют определить видовой состав моллюсков в исследуемом регионе или отдельном водоеме. Проанализировав накопленные данные, мы можем реконструировать пути их расселения, определить особенности эволюции данной группы, уточнить их таксономический статус. Идентификация видов моллюсков позволяет определить наличие или отсутствие специфичности трематод по отношению к моллюскам-хозяевам, что важно при изучении коэволюции данных групп или при организации санитарных мероприятий. Данные о видовом составе трематод, спектре их промежуточных хозяев и их распространении позволят разрабатывать более эффективные меры борьбы с ними. Результаты исследования имеют важное практическое значение для оценки и мониторинга санитарно-эпидемиологического состояния поверхностных водоемов и предотвращения заражений человека и животных», – убеждены специалисты ФГБУН ФИЦКИА УрО РАН Ольга Аксёнова и Александр Кондаков.
Итак, своевременное и точное выявление паразитов у позвоночных и беспозвоночных животных при помощи надежной молекулярной идентификации позволит выработать меры, чтобы минимизировать риски заражения человека и животных.
Все фотографии и картинки предоставлены Ольгой Аксёновой и Александром Кондаковым
