Одно из белых пятен современной медицины – аутоиммунные заболевания. Некоторые из них относительно успешно лечатся, другие, например рассеянный склероз, все еще остаются неизлечимыми, а механизмы их возникновения так и не раскрыты. Изменения в функционировании иммунной системы человека во многом связаны с деятельностью антител. Фундаментальные исследования в области биокатализа, которые РФФИ поддерживает уже более 20 лет, помогают раскрывать механизмы действия антител и приводят к важным практическим результатам. О них рассказал заведующий лабораторией биокатализа Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, член совета РФФИ, в прошлом председатель экспертного совета по международным проектам фонда академик РАН Александр Габибович Габибов.
- Александр Габибович, что такое биокатализ и почему нам важно понимать механизмы его действия?
- Напомню, что катализатор – это вещество, участвующее в химической реакции и ускоряющее ее, которое снижает энергию активации химического процесса. Как было в свое время доказано, катализатор может претерпевать и некоторые структурные изменения в ходе реакции, но высвобождается в первоначальном виде. Большинство индустриально важных процессов невозможно сейчас представить без действия катализаторов. Эта область развивается по сей день и имеет существенный экономический эффект. Например, в химической промышленности и нефтепереработке катализаторы – соединения металлов, обеспечивающие эффективность процесса при высоких температурах. А биокатализаторы – ферменты (энзимы), антитела (абзимы), молекулы РНК (рибозимы) – осуществляют химические превращения в физиологических условиях. Говоря проще, они существенно ускоряют химические реакции в организмах, в том числе и нашем с вами, в самых обычных, не экстремальных условиях.
- Давно ли начались исследования в этой области?
- Процесс изучения механизмов действия биокатализа занимал умы исследователей в течение многих лет. В середине XX в. были открыты механизмы, которые заложены в этих процессах. Одновременно стало очевидно, что понимание принципов действия биокатализаторов крайне важно для изучения деятельности живых организмов. Кроме того, почти сразу стало понятно, что достижения в этой области могут быть применены в сфере биотехнологий и медицинских технологий. Развитие науки в области биокатализа непосредственно связано с достижениями в области синтетической органической химии, физической химии, молекулярной и структурной биологии.
- Насколько успешно эти исследования ведутся у нас?
- При известном общем отставании биологических наук в России, связанном, в частности, с последствиями деятельности Т.Д. Лысенко, в области биокатализа наша страна никогда не выглядела аутсайдером. Существовали прекрасные советские школы химического катализа. Так, успешно конкурировали с западными коллегами лаборатории Н.Д. Зелинского, Б.А. Казанского и А.А. Баландина. Были отличные отечественные школы и в области биокатализаторов. Одной из лидирующих в мире была школа биокатализа академика А.Е. Браунштейна, лауреата Ленинской премии, члена Национальной академии наук США и многих европейских академий. К слову сказать, А.Е. Браунштейн был одним из реальных претендентов на Нобелевскую премию за открытие реакции трансаминирования. К этой школе в известной степени принадлежу и я. В МГУ работы в области биокатализа успешно развивал И.В. Березин, а в новосибирском Академгородке – Д.Г. Кнорре, оба ученики лауреата Нобелевской премии, одного из мировых лидеров исследования кинетики химических реакций Н.Н. Семенова.
- Исследователи биокатализа изучают различные белковые комплексы. Насколько важное место среди них занимают антитела?
-- В 1948 г. дважды нобелевский лауреат Лайнус Полинг, автор теории переходного состояния, предложил гипотезу, согласно которой антитела, полученные на аналоги переходного состояния химических реакций, могут обладать каталитической активностью. Он исходил из того, что биокатализатор, фермент наиболее приближен именно не к субстрату и продукту, а к переходному состоянию, и если удастся получить антитела на стабильный аналог этого короткоживущего соединения, то можно получить искусственный катализатор с помощью «антительной матрицы». Подтвердить это на практике не удавалось, потому что исследователи не умели получать так называемые моноклональные антитела, то есть антитела, обладающие однородными активными центрами. Возможность их получения доказали Георг Келер и Сезар Мильштейн, за что в 1984 г. были удостоены Нобелевской премии. В 1986-1987 гг. Ричардом Лернером, президентом Научно-исследовательского института им. Скриппса (США), были получены первые каталитические антитела, которые продемонстрировали достаточно эффективный катализ реакции деградации сложноэфирной связи. Эти антитела были получены на аналоге переходных состояний соответствующих ферментативных реакций. Удалось достичь достаточно приличных ускорений, хотя и не тех, которые демонстрируют истинные ферменты. Зато таким образом удалось наметить путь к получению биокатализаторов реакций, для которых нет природных ферментов, то есть удалось создать de novo катализаторы на основе антител.
Исследования в этой области особенно активно стали занимать умы исследователей в 1980–1990-е гг., эта проблематика заинтересовала многих классиков органической химии. Моя лаборатория занималась биокаталитическими превращениями биополимеров, и нам впервые в мире удалось продемонстрировать, что процесс деградации ДНК может катализироваться антителами. К сожалению, эти работы не нашли практического применения, но мы показали связь такой реакции с некоторыми аутоиммунными процессами. Таким образом, стало понятно, что так или иначе это можно использовать на практике.
- И как именно?
- С самого начала было понятно, что направление может получить практическое развитие. Дело в том, что антитело – это молекула, наиболее тропная нашему организму. В отличие от ферментов, антитела – долгоживущие белки. В отчетах современных фармацевтических компаний огромный процент лекарств в своей основе представляет собой молекулы антител. Можно назвать ремикейд, антитело против фактора некроза опухоли и одно из главных средств при ревматоидном артрите, а также ретуксимаб, антитело к маркеру В-лимфоцитов CD20, которое уничтожает патологические клетки при лимфоме. Уже из первых положительных опытов было понятно, что, если заставить антитело осуществлять каталитическую реакцию, затем это можно будет применить на практике. То есть предлагалось к важнейшей функции антител – связыванию и элиминации антигена – добавить функцию деградации. Тем самым одна молекула антитела может осуществлять уничтожение большего числа вредоносных молекул.
Катализ антителами в первую очередь представлял фундаментальный интерес. Было интересно, как антительные фолды осуществляют подобные реакции. Что делает из эффективного связывателя, байндера, молекулу, способную к катализу? Безусловно, практическое значение могут иметь антитела с каталитической функцией, деградирующие токсины, химические яды, наркотики и биополимеры. После демонстрации каталитической активности антител по отношению к ДНК удалось доказать, что то же самое справедливо и по отношению к белкам. Запрос на деградацию патологических или неправильных белков и ДНК существовал, работы в этом направлении были очень интересны.
Исследования, которыми мы занимались в 1990-е гг., демонстрировали очень хорошие успехи с точки зрения фундаментальной науки. Но у них был существенный изъян, не дававший возможности найти эффективное практическое применение. Дело в том, что искусственно полученные антитела демонстрировали довольно скромные ускорения. В случае каждой реакции мы снимаем антительный «слепок» с конкретного переходного состояния. А что если у реакции несколько переходных состояний? Эволюция движется в сторону наилучших структур, а здесь вы пытаетесь на ощупь имитировать природу. Способом, предложенном Лайнусом Полингом и впоследствии развитом Биллом Дженксом, в котором не хватало главного – имитации динамического компонента ферментативного каталитического процесса.
Полученные ускорения не соответствовали тем запросам, которые давали биомедицинская наука и современная биофармацевтика. Поэтому в начале XXI в. химики, биологи и биохимики поняли, что квантово-химические подходы к моделированию химических превращений могут дать существенный результат. Арье Варшель (Нобелевская премия по химии 2013 г.) показал успехи квантово-химических подходов в описании целого ряда биохимических реакций.
Мы предложили использовать эти подходы для улучшения свойств каталитических антител. С помощью группы исследователей из МГУ под руководством А.В. Головина наша лаборатория предложила создать матрицы для описания нескольких химических превращений. На суперкомпьютере «Ломоносов» мы просчитали массивы мутантов, которые могут обеспечить такие превращения. А на рассчитанные переходные состояния мы накладывали виртуальные поверхности антител.
Уже за три месяца исследований и расчетов этот подход привел к удивительно интересным результатам. Было получено несколько антител-мутантов, которые на два с половиной порядка увеличивали скорость химической реакции, в частности деградации фосфороорганического токсина, параоксона. Такой результат нас приятно удивил. Уверен, что в будущем исследователи с помощью таких комбинаторных подходов и расчетов на суперкомпьютере смогут получить новые антительные матрицы, учитывая несколько параметров химических превращений. И это, безусловно, будет иметь огромное практическое значение.
- Можно ли сейчас сказать, какое именно?
- Эволюция привела к созданию молекул антител для связывания и уничтожения чужого, того, что незапланированно попало в наш организм. Это и есть иммунитет, который бывает врожденным и приобретенным. Врожденный иммунитет существует у всех организмов, начиная с простейших. Его механизмы определяют, что данная бактерия вредна. А антитела – таргетно направленные молекулы. Их связывающие центры умеют очень тонко подстраиваться к молекуле-врагу. И это отличает высшие организмы от простейших.
Как говорится, при всей нелюбви к деньгам нет ничего лучше, чтобы оценивать работу других. Точно так же при всей сложности антител и возможности их моделирования нет ничего лучше для того, чтобы убрать что-то лишнее из организма. Поэтому, как я упоминал выше, фармацевтические гиганты уже около 20 лет испытывают огромный интерес к антителам, для них это один из самых интересных и точных инструментов.
И если удастся придать антителам функции не только связывания, но и катализа, и расширить эти возможности расчетами, это будет более чем интересно. Первый эшелон мы прошли – были использованы стандартные способы получения антител. Вместо молекулы для связывания выбиралось переходное состояние реакций с предположением, что удастся смоделировать химическое превращение. Нам повезло, это удалось, но не на том уровне, на котором хотелось бы. Сейчас при помощи суперкомпьютера мы пытаемся подобрать более интересные ситуации. Конечно, для этого нужно знать и данные рентгеноструктурного анализа. В прошлом такое было недоступно. И я хочу поблагодарить наши фонды, в том числе РФФИ и фонд, поддерживающий наших коллег в Европейской молекулярно-биологической лаборатории. Совместный грант EMBL и РФФИ помог нам расшифровать структуру каталитического антитела с очень высокой точностью – 1,3 ангстрема. Именно это было основой для базовых расчетов на суперкомпьютере. Гранты РФФИ, РНФ, Минобрнауки ставят нас сейчас в равные условия если и не с американскими исследователями, то с европейскими точно.
- Возможны ли были ваши исследования без поддержки грантов?
- В моей судьбе гранты в свое время сыграли существенную роль. Свой первый грант я получил на проект, посвященный деградации ДНК антителами. У меня уже была статья по этой теме, опубликованная в уважаемом международном журнале. Иностранные специалисты ее заметили и оценили, стали предлагать работу на Западе. Откровенно говоря, думал об отъезде. И решение остаться принял во многом благодаря поддержке РФФИ. Конечно, по мировым меркам она выглядела скромно, однако для меня важнее было чувствовать, что я нужен здесь.
А пять лет назад В.Я. Панченко предложил мне возглавить экспертный совет РФФИ по международным проектам, который тогда только формировался. Некоторый опыт в этой сфере у меня к тому моменту был накоплен, в том числе благодаря работе в качестве президента Федерации европейских биохимических обществ (FEBS).
Надо отметить, РФФИ и раньше проводил множество интернациональных конкурсов, а сама идея создания отдельного совета не всем казалась такой уж очевидной. Целесообразность этой инициативы подтвердила практика. Нам удалось переломить наблюдавшуюся прежде неприятную тенденцию, когда некоторые наши зарубежные партнеры были склонны больше доверять собственным экспертам, чем российским. Мы со своей стороны дипломатично, но твердо настаивали на реальном равноправии во взаимоотношениях. И постепенно ситуация стала меняться.
- Для лечения каких болезней могут особенно пригодиться результаты исследований в области биокатализа?
- Совершенно случайно в ходе работы у нас возник интерес к исследованиям рассеянного склероза. При опытах на модельных животных, развивающих аутоиммунный нейродегенеративный процесс, были обнаружены антитела, похожие на те, которые встречаются при этой болезни. Наша первоначальная концепция состояла в том, что каталитические антитела возникают в нашем организме спонтанно при патологических состояниях. При аутоиммунных состояниях идет резкое расширение репертуара антител, и этому до сих пор нет научного объяснения. В норме вы не видите весь репертуар антигенов и соответствующих антител. А при появлении патологии происходит удивительная вещь – вы видите репертуар антител на те молекулы, которые в норме у вас отсутствуют. Это было предсказано в работах Михаэля Селы, в то время президента Института им. Вейцмана в Реховоте (Израиль), и получило подтверждение. Он показал, что у модельных животных, больных аутоиммунными заболеваниями, репертуар каталитических антител в тысячу раз выше, чем у нормальных животных.
Российские исследования с этим очень корреспондировали: наша работа вышла в 1992 г., работа Михаэля Селы – в 1995 г.. В этом же русле развивались исследования Г.А. Невинского из новосибирской школы академика Д.Г. Кнорре. И сейчас более или менее ясно: при аутоиммунных состояниях расширяется репертуар антител и появляется больше вероятностей поймать их новые интересные клоны. Этот репертуар мы пытаемся искусственно расширить.
Вообще, рассеянный склероз очень интересен – тут и социальная значимость, и действительно это абсолютно неизученное заболевание.
На его исследования выделяются огромные средства, в частности колоссальные гранты в США. Но до сих пор не ясны его механизмы, неизвестно, как и чем процесс индуцируется. Понятны разве что комплексы гистосовместимости, которые ассоциируются с этим заболеванием.
Мы считали, что точно есть аутоантитела на его антигены. И мы их нашли. Мы показали, что есть антитела, которые разрезают основной белок миелина. Затем мы пошли дальше. Оказалось, что разрезание основного белка миелина происходит в определенных областях и эти области связаны с так называемыми энцефалогенными пептидами, от которых у подопытного животного может возникнуть соответствующее заболевание. Далее мы стали смотреть, нельзя ли это использовать для «ингибирования» заболевания. Тут мы опирались на работы иностранных коллег, в частности Михаэля Селы. Им было получен препарат «Копаксон», нерегулярный пептидный полимер. До сих пор до конца не ясно, как он действует, но это одно из самых эффективных на сегодня средство для лечения рассеянного склероза (если не единственное). Когда мы увидели эту специфическую деградацию основного аутоантигена, миелина, мы решили использовать работы Селы.
Интересно, что в своих исследованиях он хотел индуцировать заболевание, а получил, наоборот, лекарство. Мы, в свою очередь, нашли деградирующие пептиды и начали перебирать их структуру. Собрав несколько формуляций из двух-трех-четырех пептидов комбинаторно, мы стали исследовать их в физиологических тестах на животных. И мы обнаружили, что некоторая их комбинация явно способствует выздоровлению, конечно, не полному, но серьезно уменьшающему инвалидизацию. Нами был получен препарат под названием «Ксемус», который прошел серию доклинических испытаний в России, Израиле и еще ряде центров, и был сертифицирован. После этого мы начали клинические испытания, сейчас уже прошли вторую стадию. Скорее всего, такой комбинаторный подход даст результаты. И в самых тяжелых случаях рассеянного склероза может быть получена возможность как минимум существенно уменьшить инвалидизацию больных.
- А есть ли какая-то сугубо российская специфика в ваших исследованиях?
- Есть еще одно направление, которое частично вышло из нашего интереса к биокатализу. Нам нужно было отобрать наилучшие мутанты ферментов для захвата фосфорорганических токсинов. Мы работали с различными вариантами ферментов холинэстеразы, и мутанты по своей активности отличались довольно слабо. Нам надо было как-то разобрать репертуар на элементы.
Один из моих аспирантов, С.С. Терехов, придумал вариант так называемой микрофлюидной системы, теперь уже очень модной. В микротрубочках создаются микроконтейнеры, такие везикулы из системы «вода — масло — вода», искусственные клетки, если говорить попросту. Мы сумели создать эту систему и разобрать репертуар мутантов фермента на, так сказать, запчасти — индивидуальные клоны. Были получены очень хорошие результаты, но нас посетила идея: нельзя ли использовать этот метод для других целей – не только для сортировки клонов ферментов, но и биологических репертуаров вообще? Мы взяли микробиоту, то есть микробы ротовой полости этого же аспиранта, и стали разбирать ее на клоны. Был найден очень интересный клон, который убивает стафилококков. В итоге мы дошли до индивидуального вещества, которое производит эта бактерия, а затем пошли дальше.
Сейчас есть проблема работы с новыми репертуарами бактерий: все труднее выделять новые антибиотики, способные с ними бороться. Человеку в этом плане лучше, он живет в здоровой среде, заботится о своем здоровье. Но что происходит у диких животных? Они же питаются падалью, не следят за чистотой ротовой полости, в которой безумное количество бактерий, и тем не менее живут. Известны соответствующие функции в желудочно-кишечном тракте, но в области микробиоты это могло стать интересным объектом. И мы буквально занялись русским медведем. Один из наших академиков, представитель Сибирского отделения РАН В.В. Власов – охотник. Он решил подключиться к этим исследованиям в двух ипостасях: он сумел изловить живого медведя и совместно с нами исследовать его микробиоту. Уже найдены очень интересные бактерии, мы делаем их полногеномное секвенирование и изучаем те низкомолекулярные соединения, которые эти бактерии производят. Возможно, среди них будут интересные кандидаты на роль новых антибиотиков.
Беседовал Юрий Яроцкий
