Геном в режиме редактирования. Интервью с Дмитрием Жарковым

Нобелевскую премию по химии в 2020 году получили Дженнифер Дудна и Эмманюэль Шарпантье за открытие системы редактирования генов CRISPR-Сas. Это стало настоящим прорывом в прикладной биологии и медицинской генетике. При этом, технологии направленного изменения геномов живых организмов существовали и раньше. Генная инженерия как научная дисциплина насчитывает как минимум полувековую историю. Однако существовавшие ранее методы требовали больших усилий и времени, а успех не был гарантирован. О значимости открытия, удостоенного Нобелевской премии по химии, об этических вызовах перед современной генетикой и синтетической биологии — наш разговор с Дмитрием Жарковым.

— В 2020 году Нобелевскую премию по химии получили учёные Эммануэль Шарпантье из Франции и Дженнифер Дудна из Соединённых Штатов Америки за развитие метода редактирования генома. При этом система CRISPR-Cas, насколько я знаю, была известна и ранее, но именно Шарпантье и Дудна открыли другое важное свойство этой системы — способность раскусывать ДНК, словно ножницы, в любой последовательности. Как им это удалось и как они вообще к этому пришли?

— Всё на самом деле немного сложнее. Действительно, сама система CRISPR-Cas была открыта не Дудной и Шарпантье. Впервые эти кассеты повторов, которые называются CRISPR (от англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats — группы коротких палиндромных повторов, разделенных регулярными интервалами. — Прим. НР), были обнаружены в 1987 году группой японских учёных во главе с Ацуо Накатой у бактерии Escherichia coli, проще говоря, кишечной палочки.

Затем в 2005 году ученые показали, что эти повторяющиеся элементы происходят из геномов бактериофагов и плазмид, то есть молекулярных паразитов бактерий. Далее в 2007 году было показано, что наличие этих фрагментов, а также прилежащих к ним генов, которые назвали Cas (Cas = CRISPR-Associated Genes, «гены, ассоциированные с CRISPR». Ассоциированные – потому что находятся вблизи от CRISPR-повторов. — Прим. Д.О. Жаркова.) — необходимо для защиты бактерии от инфекции и воздействия чужеродных генетических элементов — бактериофагов и плазмид.

Только после этого началось, собственно, исследование самого механизма. Ясно, что защита от чужеродной ДНК может быть построена по-разному. Ее можно, например, связывать или расщеплять. Заслуга Дудны и Шарпантье в данном случае в том, что они показали, что ген Cas9 — он относится к так называемым CRISPR-системам II типа, которые встречаются не у всех бактерий — по сути, представляет собой единственный белок этой системы, который нужен для расщепления чужеродной ДНК. В присутствии двух РНК: crРНК или направляющей РНК и tracrРНК, то есть транс-активирующей РНК, белок становится активным и начинает расщеплять чужеродную ДНК.

— Насколько значимым оказался вклад Дудны и Шарпантье в развитие генетики?

— Вклад, конечно, огромен. Технология CRISPR-Cas стала самой прорывной технологией, которая появилась в арсенале генетических исследований после открытия полимеразной цепной реакции в 80-х годах. Буквально тысячи лабораторий по всему миру ее применяют. В России подобных лабораторий несколько десятков.

Технология CRISPR-Cas резко облегчила процессы изменения геномов на уровне целых клеток и живых организмов. В генетике к тому моменту были хорошо отработаны способы работы с изолированными генетическими элементами — плазмидами. Однако проектирование генома пусть и можно было осуществить, но с огромным трудом. Традиционные технологии получения трансгенных животных были основаны на процессе под названием гомологичная рекомбинация. Отредактированной до желаемой последовательности могла оказаться одна клетка на миллион. В случае технологии CRISPR-Cas количество отредактированных клеток достигает несколько десятков процентов.

— В 2018 году мир потрясло другое значимое событие — профессор из Китая объявил, что ему удалось отредактировать геном человека. Хэ Цзянькуй утверждал, что родившиеся девочки обладают иммунитетом против ВИЧ. Что вы думаете об этих исследованиях?

— Для научного сообщества ценность этого эксперимента равна примерно нулю, поскольку результаты не были опубликованы.

Джентльменам у нас на слово давно не верят.

Всё, что мы знаем об эксперименте, известно только со слов самого Хэ Цзянькуя, который в Китае получил три года тюремного заключения за не предусмотренные законом операции.

В принципе, технология уже сегодня позволяет менять геном у мышей и даже у человека. Так что ничего нового профессор из Китая по сути не сделал. Однако возник большой пласт этических вопросов. Имеем ли мы моральное право вмешиваться в геном человека? Не приведут ли изменения к каким-то незапланированным последствиям. Сегодня убедиться в том, что в геном внесено нужное изменение и не внесено никаких других, можно единственным способом — провести полное секвенирование этого генома. Хэ Цзянькуй заявил, что он сделал полное секвенирование на клетках из амниотической (околоплодной) жидкости. Проверку этой жидкости проводят для выявления генетических заболеваний у плода. Задача решаемая, но крайне дорогая.

Сегодня минимальная стоимость полного секвенирования генома измеряется тысячами долларов. Поэтому широкомасштабное применение метода редактирования невозможно, поскольку мы просто не узнаем, внесены ли какие-либо другие изменения. А если мы об этом узнаем на поздних стадиях жизни человека, то будет уже поздно его лечить.

Поэтому заявление китайского профессора, пусть он и разворошил этот муравейник, мы оценить не можем, поскольку нет материалов. Большой вопрос еще в том, стоит ли редактировать именно эти гены? Ген ССR5, который был мишенью в этом случае, давно рассматривался как один из основных кандидатов на редактирование генома человека. Он кодирует один из основных поверхностных белков клеток-лимфоцитов, и вирус с ним связывается для проникновения в клетку. При этом у CCR5 есть два варианта (аллеля) — условно нормальный и мутантный, который на здоровье человека почти не влияет, и даже, возможно, положительно влияет на развитие мозга, но это пока что не вполне доказано. С мутантным белком  варианта вирус не связывается и в клетки проникает значительно хуже. Возникает вопрос, стоит ли влиять на геном человека и лечить его от СПИДа именно таким образом, когда есть более традиционные способы предохраниться от заражения?

С другой стороны, понятно, что есть генетические заболевания, которые иначе, чем исправив геном человека, мы предотвратить не сможем. Но и здесь всё упирается в этику.

— Можно ли предугадать последствия вмешательства в геном человека?

— Хороший вопрос. В этом и состоит путь развития науки — мы постепенно движемся к возможности предсказывать последствия чего-либо.

В случае генома, скорее всего, до конца мы так и не научимся их определять, просто ввиду очень сложной сети взаимосвязей, которая существует в любой клетке человека, между клетками в организме и так далее. Здесь важно знать, где остановиться.

Фактически, мы никогда на сто процентов не знаем, каковы будут последствия применения любого лекарства. Но это не мешает нам их использовать. В данном случае мы также должны определить какую-то границу, где использование экстраординарных методов будет оправдано и безопасно. Но риск всегда остается.

— Распространено такое мнение, или даже метафора, что ДНК — это некий текст, который генетики буквально читают. Насколько это сравнение уместно?

— Это даже не метафора, а один из совершенно правомочных подходов к анализу ДНК. Когда я рассказываю об этом студентам, то обычно ругаю такой подход, потому что на самом деле, конечно, в ДНК никакого текста нет, а есть атомы и химические группы.  Но для целей, скажем, биоинформатики, когда мы анализируем сохранность генетической информации, эволюцию и так далее, этот подход абсолютно правомерный. Когда мы смотрим на физику взаимодействия белков с ДНК или цепочек ДНК друг с другом, такой подход уже недостаточен, и нужно искать что-то другое. Но, в принципе, да, это одно из возможных, но не полных описаний.

— Когда говорят о редактировании генома, часто упоминают персонализированную медицину. Насколько эти понятия связаны?

— На самом деле персонализированная медицина уже постепенно уходит в прошлое. Сейчас в моде другой термин — «прецизионная медицина». Например, персонализированная медицина учитывает генетическую композицию человека, то есть его генотип. Прецизионная медицина, кроме этого, учитывает состояние человека в каждый конкретный момент. Условно говоря, человек днём и человек ночью — это всегда немного разные люди, поскольку гормональный фон меняется, системы некоторых органов работают иначе. И, по-хорошему, всё это можно учитывать, но не понятно, нужно ли.

На основе генетического редактирования испытываются разные виды терапии, скажем онкологических заболеваний. Они основаны на том, что у пациента берут иммунные клетки, редактируют и вводят их обратно, чтобы они более успешно узнавали антигены опухоли данного конкретного пациента.

Но вновь главный вопрос персонализированной и прецизионной медицины не в технических возможностях, а в экономике. То есть нужно понимать, что все эти подходы они даже не на порядок, а на многие порядки дороже традиционных. Лечение, персонально подстроенное под конкретного человека, может быть крайне эффективным, но стоить десятки и сотни миллионов долларов, и понятно, что без какого-то общего изменения подхода к таким видам терапии мы в широкое обращение их никак не введем.

— То есть пока врачи продолжат лечить людей традиционными методами?

— Безусловно, врачи еще долго будут спасать жизни людей традиционными методами. Большое им за это спасибо. Но медицинские и генетические технологии не стоят на месте. Хорошая новость в том, что все виды геномной терапии и геномного редактирования обладают свойством универсальности. Взять хотя бы технологию CRISPR-Cas. По сути, она не нуждается в изменении, когда нужно включать ген А или ген В. В отличие от традиционной фармакологии, где для каждого белка-мишени необходима своя активная молекула, а разработка каждого из лекарств занимает долгие годы и стоит огромных денег. В случае CRISPR-Cas достаточно поменять маленькую направляющую РНК и продолжить работу уже с другим геном. И это то преимущество, с которым, безусловно, в будущем будет связано развитие генной терапии.

— Поговорим о ваших исследованиях. Недавно вы совместно с коллегами из Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН и Новосибирского государственного университета создавали некий коктейль из белков для работы с деградированной ДНК. Расскажите подробнее об этом исследовании и чего вам удалось достичь во время его реализации?

— Исследование пока не закончено. В данном случае деградированная ДНК позволяет наработать данные для последующего анализа. Это актуальная задача, особенно для исследования древней ДНК ископаемых останков. Помимо этого, данный метод подойдет при судебно-медицинской экспертизе, для анализа происхождения ДНК в продуктах питания глубокой переработки, анализа ДНК из медицинских архивных образцов, которые были когда-то законсервированы.

На протяжении долгих лет мы работаем с репарацией ДНК — комплексом из многих ферментов, которые защищают нас от мутации. Поскольку человеческая ДНК постоянно повреждается, в одной клетке каждый день возникают сотни тысяч повреждений. При этом они не превращаются в мутации, клетка не гибнет, только потому что у нас активно работает система репарации. Но после смерти, понятно, что системы работать перестают и ДНК начинает постепенно разлагаться, окисляться, гидролизоваться. Специалисты утверждают, что естественный предел существования ДНК вне организма не превышает примерно ста тысяч лет. Все, что древнее, мы практически никак не можем из этих ископаемых останков вытащить и проанализировать.

Поэтому очередные сообщения о том, что удалось найти бактерии, которые сорок миллионов лет пролежали где-то в янтаре или в кристалле соли, как правило, при проверке оказывались недостоверными. Так вот, зная, как работает система репарации в организме человека, в бактериях и так далее, мы сделали свою смесь из нескольких ферментов репарации. Вместе с коллегами из Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН мы опробовали её на некоторых древних образцах, возраст которых достигал сорока тысяч лет. Чем древнее ДНК, тем больше улучшается способность амплифицировать, вытаскивать ДНК из древних образцов. Но повторюсь, что исследования продолжаются.

— Благодаря вашему методу количество кусочков ДНК увеличивается?

— Да, фактически, эта смесь исправляет разрывы в ДНК или окисленные нуклеотиды и позволяет при подготовке образцов для секвенирования с этими кусочками работать.

— Перейдем к другому интересному направлению под названием синтетическая биология. Насколько стремительно оно развивается и в связи с чем появилось?

— Синтетическая биология — это название-зонтик, которое покрывает очень много разных направлений, начиная с того же геномного редактирования и кончая созданием модифицированных организмов. Для себя мы определяем синтетическую биологию как некое полуинженерное направление, которое использует фундаментальные знания, накопленные в молекулярной биологии и биохимии за последние пятьдесят лет с момента открытия свойства ДНК как носителя генетической информации. В 2023 году сообщество генетиков и биохимиков будет отмечать 70-летие открытия того, как именно в ДНК хранится генетическая информация.

Синтетическая биология возникла как попытка на основе накопленных знаний научиться предсказывать то, как будут вести себя конкретные системы на уровне отдельных белков, молекул и целых организмов и на основе этого создавать белки и клетки тканей организма с заданными параметрами и характеристиками. Поскольку эта отрасль науки не имеет выделенного объекта изучения, то мы имеем широкий разрозненный набор попыток получения модифицированных биологических систем разного уровня.

Время от времени случаются «вау-моменты». Скажем, несколько лет назад мне понравился видеоролик, где учёные заставили человеческие клетки производить белки паутины. И у них была очень эффектная демонстрация. Ученые брали лоскут ткани, засеянный этими клетками, стреляли в него из пистолета, и пуля не пробивала его, поскольку паутина на разрыв крайне прочная. Они рекламировали технологию как возможное новое синтетическое волокно для бронежилетов. Но с тех пор мы что-то новых бронежилетов не видели. Пока это можно считать эффектным экспериментом, который показывает, чего мы в принципе можем добиться.

Ведутся работы со специально выведенными растениями, которые начинают флюоресцировать, если в почве есть взрывчатое вещество. Фактически, синтетическая биология — это попытки человечества сделать биологические объекты более понятными для манипуляции.

— Есть ли какие-то применения, например, для создания тканей или органов?

— С тканями и органами сейчас ведется очень активная работа. По сути, одно из магистральных направлений развития, но пока что мы ограничены тем, что пытаемся сделать ткани и органы пока ещё не модифицированные. Совсем недавно наблюдалась волна ожиданий по поводу стволовых клеток. Казалось, будто мы можем взять любую клетку человека и перепрограммировать ее в стволовую клетку, а затем в какую-то другую. И в целом, это возможно. Но мы пока ещё не можем создавать искусственные ткани и органы с той плотностью клеток, которые позволяли бы нормально применять их в медицине. Хотя направление, безусловно, развивается так активно, что мы скоро к этому придем. В России такие работы тоже ведутся.

— Где, например?

— Скажем, в Сколково есть компания «3D Bioprinting Solutions», которая занимается 3D-биопринтингом или изготовлением синтетических матриц, которые потом засеиваются клетками человека, что может стать основой для получения в дальнейшем тканей и органов.

— Подведем некий итог нашей беседы. Как вы считаете, несут ли манипуляции с человеческими генами опасность или всеобщее благо?

— Вы же понимаете, что вопрос этот совершенно риторический. В мире нет ни одной технологии, которую на 100% можно назвать благом или злом. Разумеется, как и любая технология, все биологические технологии могут быть использованы и на благо человечества, и могут нести существенные риски. И, собственно, задача ученых состоит в том, чтобы вести диалог с обществом, объяснять, какими возможностями обладает наука, почему какие-то опасения обоснованные, а какие-то необоснованные. Только совместно можно достичь компромиссов по вопросам полезности той или иной новой технологии. Конечно, каждая из них всегда будет сопряжена с некими рисками, но, в общем-то, человечество уже давно научилось и принимать риски, и как-то ими управлять.

Фото: photojog / 123 RF